母乳喂养的新生儿病理性黄疸患儿肠道菌群结构变化观察

徐文秀，张楠，邢雪雪，葛阳，李书玮，毕玫荣

1 潍坊医学院临床医学院，山东潍坊 261053；2 济南市中心医院新生儿科

新生儿黄疸是指新生儿时期由于血清胆红素水平异常代谢使血清胆红素升高，导致新生儿皮肤、巩膜、黏膜等部位出现黄染的一种现象，可分为生理性黄疸和病理性黄疸两种，生理性黄疸无明显并发症。母乳喂养的新生儿可能在出生后一周内，由于生后数天内热卡和液体摄入不足、排便延迟等因素导致血清胆红素升高。新生儿病理性黄疸又称为新生儿非生理性高胆红素血症，是指各种原因导致的血清胆红素水平异常增高或胆红素增高性质的改变，主要表现为皮肤、黏膜或其他器官黄染，可伴有嗜睡、反应差等神经受损表现。生理、免疫、遗传改变和环境因素均可能导致新生儿病理性黄疸［1-3］。最新研［4-8］究发现，肠道菌群失调是新生儿高胆红素血症的致病因素之一。肠道菌群可能通过肠—肝轴的代谢途径、免疫变化参与高胆红素血症的发生发展［9］。母乳喂养可能对新生儿早期肠道菌群结构建立有一定的影响［8］。母乳喂养新生儿肠道菌群失衡和代谢物异常是否与新生儿病理性黄疸的发生发展有关，目前尚不清楚。为此，我们采用高通量16S rRNA 基因测序技术检测母乳喂养新生儿病理黄疸患儿粪便肠道菌群，观察其肠道菌群结构变化，现报告如下。

1 资料与方法

1 临床资料 选取2021年11月—2022年3月济南市中心医院新生儿科收治的30 例新生儿病理性黄疸患儿作为观察组，患儿的出生胎龄在38～41（39.20 ± 1.08）周，入院日龄2～5（3.27 ± 1.03）天，其中男14 例、女16例；另选择 30例同时期本院产科出生的健康足月儿为对照组，出生胎龄38～41（39.13 ± 0.92）周，日龄2～5（3.33 ± 0.98）天，其中男15 例、女15 例。观察组患儿血清总胆红素（158.50 ± 32.47）mmol/L，直接胆红素（16.24 ±6.39）μmol/L，间接胆红素（143.06 ± 31.71）μmol/L。符合第九版儿科学病理性黄疸的诊断标准［10］，出现下列任一项情况应考虑病理性黄疸：①生后24时内出现黄疸；②血清总胆红素值已达到相应日龄及相应危险因素下的光疗干预标准，或超过小时胆红素风险曲线的第95 百分位数；或胆红素每日上升超过85 μmol/L（5 mg/dL）或每小时＞0.5 m/dL；③黄疸持续时间长，足月儿＞2周，早产儿＞4周；④黄疸退而复现；⑤血清结合胆红素＞34 μmol/L（2 mg/dL）。纳入标准：①符合诊断标准；②入组的新生儿仅为血清胆红素水平超过相应日龄、相应胎龄下蓝光干预值的病理性黄疸，住院期间仅需要接受蓝光照射治疗。③观察组和对照组在性别、出生日龄及体重等方面比较均无统计学意义。④所有婴儿纯母乳喂养，母亲身体健康，无妊娠期合并症，以排除婴儿饮食对肠道菌群差异的影响。排除标准：①有其他病理情况，如先天异常、出生缺陷、肝功能异常、消化道畸形、胆道及肠道疾病等的婴儿；②服用过益生菌制剂、因感染服用过抗生素等药物的婴儿。本研究中所有家属均已知情同意，并签署知情同意协议书，同时本研究经济南市中心医院伦理委员会批同意，伦理号为（GZR2020-001-03）。

1.2 两组粪便标本肠道菌群检测 采集观察组患儿入院后的第一次粪便，每采集一个观察组患儿粪便，于产科采集同时期正常健康的足月儿粪便1次，标本置于-80 ℃冰箱中保存。采用高通量16S rRNA基因测序技术检测两组新生儿粪便标本肠道菌群：①对粪便标本进行DNA 的提取（试剂盒commercial kit （Qiagen， Hilden， Germany））与质量检测；②目的区域PCR 扩增（扩增引物如下：PrimerF=Illumina adapter sequence 1 + CCTACGGGNGGCWGCAG；Primer R=Illumina adapter sequence 2 + GACTACHVGGGTATCTAATCC）；③检测扩增产物（琼脂糖凝胶电泳）；④文库构建（Agilent 2100 Bioanalyzer）；⑤测序（illumina 2×250 bp 的双端测序策略）；⑥质控（TrimGalore软件）。

1.3 两组粪便标本肠道菌群生物信息分析 对获取的数据进行统计学分析，包括多样性分析［操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）、β 多样性分析］、Heatmap 分析、LEfSe 分析（展示肠道微生物群的相对丰度）、功能预测性分析（是指把组间相对丰度显著差异的功能绘制成条形图，预测菌群的生物学功能）。β 多样性分析通过降维的方法来考察样本与样本之间的相似度和关系，种属构成特征。Heatmap 分析是指用颜色的深浅来显示肠道菌群的丰度，通过颜色的梯度和相似程度反应出肠道菌群的相似性和差异性，并对数据进行可视化处理。LEfSe 分析支持高维分类比较，可用于筛选最可能解释组间差异的物种，LDA score 的绝对值＞3为两组具有统计学差异的微生物菌群。功能预测分析使用PICRUS工具可以基于扩增子测序数据，对其肠道菌群的功能进行预测和分析，使用Welch’sT-test筛选两组中具有显著差异的功能。

1.4 统计学方法 本研究采用SPSS 22.0 统计软件和R软件进行数据处理。正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验；根据16S rRNA序列的总和来计算每个样本的相对丰度，观察组和对照组在目、属、种各分类水平上的显著差异菌群采用Mann-WhitneyU检验；采用 Pearson相关性分析法分析观察组患儿优势肠道菌群与血清总胆红素水平、直接胆红素水平、间接胆红素水平的相关性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

两组粪便标本检测到高质量序列有12 842 623条，平均每个样本有324 347条。长度409 bp是干净序列的集中分布处。两组粪便标本检出肠道菌群共131 个种、128 个属、71 个科、38 个目、25 个纲、16 个门，最终得到342 个OTU。观察组、对照组肠道菌群OTU 数分别为228、323 个，其中二者共有OTU 210个，观察组特有OTU 18个、对照组特有OTU 113个。与对照组比较，观察组患儿粪便肠道菌群在门、纲、目、科、属、种各水平的细菌分类OTU 数均少（P均＜0.05）。在目水平上，观察组、对照组芽孢杆菌的绝对丰度分别为149 135.5、4 250 701.3（Z=2.065，P=0.039）；在属水平上，观察组、对照组普拉梭菌的绝对丰度分别为17 400 549.9、255 143 407.6（Z=2.248，P=0.025），观察组、对照组柠檬酸杆菌的绝对丰度分别为7246.2、0（Z=2.473，P=0.013）；在种水平上，观察组、对照组脆弱拟杆菌的绝对丰度分别为668889.3、8760389.6（Z=2.289，P=0.022）。LEfSe分析结果显示，观察组影响力较大（LDA score ＞3）的肠道菌群为丁酸梭菌、鞘脂单胞菌及鞘氨单胞菌属，对照组（LDA score ＞3）的肠道菌群有脆弱拟杆菌、毛螺菌属。功能预测分析结果显示，与对照组比较，观察组患儿参与矿质养分吸收、孢子形成、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、聚酮糖单位生物合成功能通路的肠道菌群丰度更低（P均＜0.05）。

观察组患儿芽孢杆菌与血清总胆红素、直接胆红素、间接胆红素水平均无关（r分别为-0.363、-0.195、-0.303；P均＞0.05）。观察组患儿柠檬酸杆菌与血清总胆红素、直接胆红素、间接胆红素水平均无关（r分别为-0.029、-0.027、0.054；P均＞0.05）。观察组患儿普拉梭菌、脆弱拟杆菌丰度与血清总胆红素水平呈负相关（r分别为-0.727、-0.027；P均＜0.05），观察组患儿普拉梭菌、脆弱拟杆菌丰度与血清间接胆红素水平呈负相关（r分别为-0.730、-0.730；P均＜0.05），观察组患儿普拉梭菌、脆弱拟杆菌丰度与血清直接胆红素水平无关（r分别为-0.118、-0.118；P均＞0.05）。

3 讨论

肠道微生物群（即肠道共生微生物）被认为是人体的“器官”，在新生儿的病原体保护、营养、代谢和免疫成熟等方面发挥着重要作用。肠道微环境的改变促进机会致病原体的生长，减少共生细菌的丰度，即肠道菌群失调［11］。目前多项研究［6-8］结果表明，新生儿高胆红素血症患儿存在肠道菌群失调。在一项对51例新生儿黄疸的婴儿的肠道菌群研究表明，与非新生儿黄疸婴儿相比，新生儿黄疸婴儿肠道微生物多样性降低，双菌属下降，在门水平上厚壁菌门和放线菌门增加，变形菌门和梭菌门减少［6］。研究表明与健康新生儿相比，新生儿高胆红素血症患儿肠道微生物菌群的多样性减少，双歧杆菌、乳杆菌数量减少而大肠埃希菌数量增加［7］。在对母乳黄疸新生儿肠道菌群的研究表明肠道菌群的丰富度和多样性无显著差异；但是肠道菌群的结构存在差异，在门水平上，母乳黄疸组的变形杆菌含量增加，对照组中厚壁菌数量增加。在属水平上，母乳黄疸组埃希氏菌、摩根氏菌和罗氏菌的数量减少，对照组中嗜血杆菌数量增加［8］。本研究表明，新生儿高胆红素血症患儿肠道菌群数量和多样性降低，与对照组相比观察组的肠道菌群群落结构分布存在显著差异，在各水平细菌分类OTU 数均较少。观察组患儿血清总胆红素水平和间接胆红素水平与普拉梭菌和脆弱拟杆菌呈负相关，说明血清胆红素水平与肠道菌群有一定的相关性。

本研究中芽孢杆菌目、普拉梭菌属、脆弱拟杆菌种在对照组丰度更高。芽孢杆菌属于革兰氏阳性杆菌，广泛存在于人的胃肠道内。芽孢杆菌具有抗氧化及抑制肠道内病原菌黏附的作用。芽孢杆菌中存在的活性化合物其基本功能是抑制病原体的繁殖。芽孢杆菌中还有三种细菌素，这些细菌素可以控制腐败和病原微生物的繁殖［12-13］。芽孢杆菌还可以调节肠道菌群平衡，增加产丁酸细菌如毛螺菌属的丰度［14］。研究［15］表明地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等在治疗新生儿高胆红素血症及母乳性黄疸中可以明显降低血清中的胆红素水平，缩短光疗的时间，加速黄疸的消退。芽孢杆菌对新生儿黄疸的机制可能与其能改善肠道菌群失调，促进有益菌以及抑制病原菌有关。普拉梭菌又名为普氏栖粪杆菌，属于梭状芽胞杆菌属第 IV 类群，即柔嫩梭菌类群，是人体肠道内的有益菌群，可以利用多糖产生大量短链脂肪酸（SCFAs），普拉梭菌还对胆汁酸生理浓度的增加高度敏感，0.1 μg/mL 胆酸即可抑制其生长［16］。许多小分子代谢产物是由肠道菌群和宿主共同代谢产生的，胆汁酸就是其中之一。肠道菌群调节胆汁酸的合成和代谢，胆汁酸影响肠道菌群的数量和结构，通过调节宿主的内部炎症反应来提高宿主的免疫功能，它们形成相互影响和调节的密切关系［17］。研究［18］表明经人工喂养的新生儿高胆红素血症患儿在接受光疗之后胆汁酸含量增加。这可能是我们研究中观察组普拉梭菌丰度较低的原因之一。健康的肠道菌群多样性较高。脆弱拟杆菌属于拟杆菌门，是宿主体内的正常定植菌，可以高效降解多糖产生大量SCFAs［19］。在健康婴儿的粪便中分离出的一种脆弱拟杆菌菌株，可以通过STAT3 信号通路促进紧密连接蛋白表达保持肠道屏障的完整性［20］。脆弱拟杆菌可以水解胆红素，在体内和体外条件下，能减少尿胆素原水平，包括双氢胆红素、中胆红素、粪胆素原等［21］。毛螺菌属与多种疾病有关，存在于大多数健康个体的肠道中，可能是一种潜在的有益细菌，可以参与多种碳水化合物的代谢，通过其代谢物在维持肠粘膜免疫调节的动态平衡中具有重要作用，其丰度与血清IgG 水平呈正相关［22-23］。目前关于该菌的研究和证据还不是很多，还仅限于关联性研究，在机制方面研究较少。

本研究发现对照组丰度较高的细菌是产生短链脂肪酸的主要细菌。SCFAs 也称为挥发性脂肪酸，是碳原子数小于6 的有机脂肪酸的总称，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸及戊酸。SCFAs主要来源是结肠中厌氧菌对肠道纤维和多糖的发酵、部分氨基酸分解代谢产生及脂肪酸的氧化［24］。脆弱拟杆菌是乙酸、丙酸和丁酸的生产者，普拉梭菌可以产生丁酸和少量的乳酸，毛螺菌属是乙酸和丁酸的生产者［16，19，22］。SCFAs如乙酸、丁酸等可以降低肠道的PH 值，当肠道处于酸性环境时，β-葡萄糖醛酸苷酶（β-GD）的活性会降低使未结合胆红素生成减少，有利于减轻新生儿高胆红素血症。SCFAs还可以通过降低肠道PH 值，促进共生菌的生长，抑制病原菌的繁殖。柠檬酸杆菌是一种致病性细菌，可以导致肠道菌群失调，SCFAs 可以增加宿主对柠檬酸杆菌感染的抵抗力。SCFAs如丁酸还可以通过促进胃肠道肌肉的收缩和神经递质的传递，从而促进肠道的蠕动，使肠肝循环中的胆红素排泄增多，丁酸还可以通过增加紧密蛋白的连接来维持肠壁的完整性［11，25-26，31］。李雁彬等［5］研究表明，胆红素脑损伤组患儿肠道菌群属水平丰度低于无胆红素脑损伤组，梭菌、梭杆菌、琥珀酸弧菌、拟杆菌等产短链脂肪酸的细菌显著减少，表明肠道菌群数量及多样性的减少导致短链脂肪酸生成减少，影响肠肝循环中胆红素的清除。

本研究中功能预测分析结果发现，观察组在孢子形成、矿质养分吸收、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、聚酮糖单位生物合成等功能通路丰度降低。研究表明胆汁淤积的患儿肠道微生物群组成改变后其氨基酸代谢、糖代谢及膜转运等功能会出现明显减弱［27］。枯草芽孢杆菌的蛋白质可以参与孢子合成与降解，营养细胞有能力在产孢过程中转化为孢子这需要营养物质及非营养物质的刺激，此外芽孢杆菌的抗菌化合物有两种系统：非核糖体肽合成酶（NRPS）与聚酮合成酶（PKS）。PKS系统可以产生具有抗菌活性的聚酮类化合物［12-13］。肠道微生物与矿质养分、氨基酸、多糖之间具有相互作用。矿质离子对人体的健康及肠道微生物的平衡具有重要的作用，益生菌对矿质离子吸收的促进作用也与肠道菌群的组成和代谢有关，肠道微生物群可以通过产生短链脂肪酸降低肠道PH 值从而促进钙离子、镁离子等矿质养分吸收，矿质离子本身也具有提供益生元的效应，补充富含钙和镁的海洋矿物质混合物的膳食补充剂可以增强大鼠肠道中产短链脂肪酸的微生物多样性和组成［28-30］。肠道菌群可以代谢人体内不能消化的多糖，普拉梭菌有碳水化合物分解代谢相关的基因（如唾液酸酶基因）。脆弱拟杆菌存在高效降解多糖系统，其外膜囊泡（OMVs）成分有助于分解复杂的多糖、蛋白质和脂质。毛螺菌属也参与多种碳水化合物的代谢。摄入膳食多糖可以影响肠道菌群的平衡，多糖如膳食纤维的摄入可以增加肠道中拟杆菌的数目［28，16］。补充精氨酸还可以通过细胞因子和肠道菌群促进小鼠肠道SIgA 分泌，氨基酸摄入增多及膳食纤维等多糖的缺乏会促进柠檬酸杆菌的增殖［31］。这提示肠道菌群组成发生改变会导致肠道菌群的代谢功能出现变化。这种功能通路的改变具体引起体内哪种物质的改变，我们后续可以通过结合代谢组学进行更深入的研究。

综上所述，母乳喂养的新生儿病理性黄疸患儿与正常健康婴儿肠道菌群存在差异，患儿肠道菌群以普拉梭菌、脆弱拟杆菌为主，主要生物学功能为聚酮糖单位生物合成、D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢及孢子形成等。肠道菌群可能通过影响肠道某些代谢通路如氨基酸代谢、糖代谢、矿质成分的吸收，影响母乳喂养新生儿胆红素的清除。