吡咯啉-5-羧酸合成酶在人肝癌组织中表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察

张玉衡，陈鸣，曹科，王刚，朱章华，虞文魁

南京大学医学院附属鼓楼医院重症医学科，南京 210009

肝癌是世界第六大常见的恶性肿瘤。单独应用靶向药物治疗晚期肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma， HCC）的效果不佳，部分患者在治疗后发生耐药［1-2］。因此，探索HCC 的细胞耐药机制是目前的研究重点与难点。铁死亡是一种新发现的调节性细胞死亡形式，主要表现为铁催化的脂质过氧化物对细胞各类膜结构的破坏，被以还原性谷胱甘肽（Glutathione， GSH）-谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase 4， GPX4）为主的抗氧化系统负性调控［3］。研究［4］发现，索拉非尼等靶向药物在诱导HCC 肿瘤细胞凋亡、抑制血管新生的同时，还可抑制肿瘤细胞脂质过氧化物的产生、上调抗抗氧化系统GSHGPX4 的活性，抑制HCC 细胞铁死亡，最终导致肿瘤耐药。吡咯啉-5-羧酸合成酶（Pyrroline-5-carboxylate synthase， P5CS）是催化脯氨酸合成的限速酶之一，除催化合成作用外还能维持细胞内GSH 含量，从而保护肿瘤细胞免受氧化应激损伤，具有潜在的抗氧化作用［5］。P5CS 可通过增加脯氨酸的合成，促进肿瘤的发生发展，但具体作用机制尚不明确［6］。P5CS 是否通过调控肝癌细胞的铁死亡影响细胞耐药，目前相关研究较少。为此，2023 年1-6 月，我们观察了P5CS 在HCC 组织中的表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用，进一步探讨其可能作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 HCC 癌组织及癌旁组织P5CS 检测 2020 年9月—2021 年9 月间于南京鼓楼医院就诊的HCC 患者10 例。患者纳入标准：①结合临床表现、影像学诊断（B 超/增强CT 或MRI）和血清AFP 检测（≥400 μg/L）临床确诊为HCC；②术前未经放疗、化疗和靶向治疗；③不伴有其他类型肝占位、肝内胆管结石等。排除标准：①不愿意接受手术治疗或出现肝内/肝外广泛转移，暂无法进行手术治疗；②肝功能和/或其他脏器功能出现严重不全，无法耐受手术治疗；③术后病理证实为非HCC 的其他类型肝癌。10例患者均留取HCC 组织和对应癌旁组织（≥5 cm）标本，并对标本的使用知情同意。取HCC 及癌旁组织，固定后石蜡包埋切片，Triton-X 通透组织细胞后封闭非特异性抗原，anti-P5CS 一抗孵育，4 ℃过夜。次日孵育二抗并滴加DAB 显色剂，苏木素复染后封片观察。染色强度为阴性计0 分、弱阳性计1 分、阳性计2 分、强阳性计3 分；阳性染色细胞（阳性、强阳性染色强度细胞）百分比为＜25%者计1 分、26%～50%者计2 分、51%～75%者计3 分、76%～100%者计4 分；以染色强度、阳性染色细胞百分比相加为P5CS 的蛋白的相对表达量。重复测算3 次，取平均值。

1.2 P5CS 对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察

1.2.1 细胞、试剂及仪器 人肝癌细胞系Li-7、Huh-7 购自中国科学院上海细胞库；Huh-7 在含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基中培养，Li-7 在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中培养，置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱内。siALDH18A1［乙醛脱氢酶家族18成员A1（ALDH18A1）基因可编码P5CS 蛋白，基因序列GTTCGTTCTTGGAGCAACA］购自广州锐博生物；逆转录及荧光定量PCR 试剂盒购自武汉赛维尔公司；qPCR所需引物购自北京擎科生物，具体序列GAPDH 基因qPCR 引物正向序列TCAAGGCTGAGAACGGGAAG、反向序列TCGCCCCACTTGATTTTGGA，ALDH18A1 基因qPCR引物正向序列GCCCTTCAACCAACATCTTCT、反向序列AGGGGTACAGTGATAAACGGG，ACSL4 基因qPCR 引物正向序列GCTATCTCCTCAGACACACCGA、反向序列AGGTGCTCCAACTCTGCCAGTA，LPCAT3 基因qPCR 引物正向序列GGAGCTGAGCCTTAACAAGTT、反向序列CAAAGCAAAGGGGTAACCCA，15-LOX 基因qPCR 引物正向序列ACC TTCCTGCTCGCCTAGTGTT、反向序列 GGCTACAGAGAATGACGTTGGC。一抗（anti-P5CS、anti-β-actin、anti-SLC7A11、anti-GPX4）及二抗（羊抗鼠、羊抗兔）购自美国Proteintech 公司；CCK8 试剂盒购自武汉赛维尔公司；细胞活性氧簇（ROS）检测试剂盒、转染试剂Lipo8000™购自碧云天生物公司；C11-BODIPY染料购自美国Thermo Fisher公司；SLC7A11靶向抑制剂Erastin、GPX4 靶向抑制剂RSL-3 购自美国Selleck公司。

1.2.2 Li-7、Huh-7 细胞培养及siALDH18A1 转染方法 取接种于6 孔板内的对数生长期 Li-7、Huh-7细胞，按说明书将适量Lipo8000™和siALDH18A1 混合，室温孵育15 min 后转染细胞，控制siALDH18A1终浓度为50 nmol/L。继续培养48 h 后TRIzol 提取总RNA，采用qPCR 法检测细胞ALDH18A1 mRNA，与转染前比较，转染48 h 时Li-7、Huh-7 细胞中ALDH18A1 mRNA 相对表达量减少至27.10 ± 13.30、30.20 ± 3.60（P＜0.05），采用WESTERN Blotting 法检测转染前后Li-7、Huh-7 细胞P5CS 蛋白，转染前Li-7、Huh-7 细胞P5CS 蛋白相对表达量分别为1.07 ± 0.23、0.65 ± 0.02，转染后Li-7、Huh-7 细胞P5CS 蛋白相对表达量分别为0.35 ± 0.01、0.02 ±0.01，转染前后Li-7、Huh-7细胞P5CS蛋白相对表达量比较，P均＜0.05。说明转染siALDH18A1后，Li-7、Huh-7 细胞中P5CS 蛋白被成功抑制，可进行后续实验。

1.2.3 转染前后人肝癌细胞系铁死亡程度观察采用C11-BODIPY 荧光探针检测转染前、后Li-7 及Huh-7 细胞内脂质过氧化物含量。C11-BODIPY 是一种脂溶性的荧光探针，能够自由进入细胞并与细胞或细胞器膜结合，借助流式细胞仪可以在不破坏细胞膜完整性的情况下检测细胞膜及细胞内脂质过氧化物的含量，是目前已知准确度最高的铁死亡检测指标之一［7］。取转染前后的Li-7、Huh-7 细胞培养至汇合度80%～90%时，换液并加入5 μmol/L 的C11-BODIPY，37 ℃避光孵育20 min。用无血清培养基洗涤细胞3 次，胰酶消化后PBS 重悬，用流式细胞仪FITC 通道测算细胞脂质过氧化物含量，重复测算3次，取平均值。

1.2.4 转染前后人肝癌细胞系脂质过氧化物合成相关基因ACSL4、LPCAT3、LOX-15 检测 采用qPCR 法检测转染前、后Li-7 及Huh-7 细胞内ACSL4、LPCAT3、LOX-15 基因的mRNA，所有操作均同“1.2.2”。重复测算3次，取平均值。

1.2.5 转染前后人肝癌细胞系SLC7A11、GPX4 蛋白检测 采用WESTERN Blotting 法检测转染抑制前、后Li-7 及Huh-7 细胞内SLC7A11、GPX4 蛋白。收集6孔板内Li-7及Huh-7细胞并使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h 孵育相应一抗，4 ℃过夜，TBST 洗去膜上多余一抗，室温孵育相应二抗2 h，加入ECL 显色液曝光。Image J 软件测算SLC7A11、GPX4 蛋白灰度值，重复测算3次，取平均值。

1.2.6 加入Erastin 的Li-7、Huh-7 细胞铁死亡程度观察 Li-7、Huh-7 细胞分别转染对照siRNA（D 组）或siALDH18A1（E 组），转染48 h 时分别取Li-7 及Huh-7 细胞，各分为2 组，每组6 个复孔。其中E 组细胞换液后加入5 μmol/L 的Erastin，D 组换液后加入同体积的DMSO 作为对照，继续培养24 h。采用C11-BODIPY 荧光探针检测Li-7 及Huh-7 细胞两组脂质过氧化物含量，所有操作均同“1.2.3”。重复检测3次，取平均值。

1.2.7 加入RSL-3 的Li-7、Huh-7 细胞铁死亡程度观察 Li-7、Huh-7 细胞分别转染对照siRNA（D 组）或siALDH18A1（E 组），48 h 时分别取Li-7 及Huh-7细胞，各分为2组，每组6个复孔。抑制前、抑制后的R组细胞换液后加入5 μmol/L的RSL-3，D组换液后加入同体积的DMSO 作为对照，继续培养24 h。采用C11-BODIPY 荧光探针检测Li-7 及Huh-7 细胞两组脂质过氧化物含量，所有操作均同“1.2.3”，采用CCK-8 试剂盒检测细胞活性，重复检测3 次，取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理，采用Graphpad Prsim 8.0软件绘图。计量资料通过Shapiro-Wilk 进行正态性检验，符合正态分布的以-x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，不同处理组内、组间比较采用两因素方差分析；方差分析前检验方差齐性，方差不齐者进行秩变换后具备方差齐性，再进行方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 及癌旁组织P5CS 蛋白相对表达量比较 HCC 及癌旁组织P5CS 蛋白相对表达量分别为6.80 ± 2.10、0.40 ± 0.20，二者比较，P＜0.05。

2.2 P5CS对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用

2.2.1 转染前、后Li-7 及Huh-7 细胞脂质过氧化物含量比较 转染前Li-7 及Huh-7 细胞脂质过氧化物含量分别为1.00 ± 0.01、1.00 ± 0.02，转染后Li-7及Huh-7 细胞脂质过氧化物含量分别为1.05 ±0.03、0.95 ± 0.03，二者比较，P均＞0.05。

2.2.2 转染前、后Li-7 及Huh-7 细胞ACSL4、LPCAT3、LOX-15 基因相对表达量比较 转染后Li-7细胞ACSL4、LPCAT3、LOX-15 基因相对表达量分别为转染前的74.00 ± 6.10、30.60 ± 29.70、31.30 ±9.50，转染后Huh-7 细胞的三种基因相对表达量分别为转染前的53.50 ± 11.10、31.90 ± 7.50、72.00 ± 12.70。与转染前比较，转染后Li-7 及Huh-7 组细胞三种脂质过氧化物合成基因相对表达量间比较，P均＞0.05。

2.2.3 转染前后Li-7 细胞SLC7A11、GPX4 蛋白相对表达量比较 转染前、后Li-7 细胞SLC7A11 蛋白相对表达量分别为0.48 ± 0.07、0.17 ± 0.01，二者比较，P＜0.05；转染后Li-7 细胞GPX4 蛋白相对表达量分别为00.29 ± 0.01、0.05 ± 0.01，二者比较，P＜0.05。

2.2.4 转染前后加入Erastin 的Li-7、Huh-7 细胞脂质过氧化物含量比较 加入Erastin 诱导铁死亡后，转染前Li-7 E 组、Huh-7 E 组细胞脂质过氧化物含量分别为1.03 ± 0.01、1.03 ± 0.01；转染后Li-7 E 组、Huh-7 E 组细胞脂质过氧化物含量分别为1.15 ±0.03、1.17 ± 0.02。与转染前比较，转染后Li-7 E组、 Huh-7 E 组细胞脂质过氧化物含量升高（P均＜0.05）。

2.2.5 转染前后加入Erastin和RSL-3的Li-7、Huh-7细胞脂质过氧化物含量及细胞活性比较 转染前Li-7 E 组、Li-7 R 组、Huh-7 E 组、Huh-7 R 组细胞脂质过氧化物含量分别为1.27 ± 0.01、1.05 ±0.02、1.23 ± 0.01、1.16 ± 0.03；转染后Li-7 E组、Li-7 R 组、Huh-7 E 组、Huh-7 R 组细胞脂质过氧化物含量分别为1.31 ± 0.02、1.21 ± 0.02、1.29 ±0.01、1.23 ± 0.02。与转染前比较，转染后Li-7 E组、 Li-7 R 组、Huh-7 E 组、Huh-7 R 组细胞脂质过氧化物含量高（P均＜0.05）。转染后Li-7 R 组、Huh-7R 组细胞相对活性分别为78.04% ± 1.79%，81.16% ± 0.40%，Li-7 E 组、Huh-7 E 组细胞相对活性分别为89.22% ± 1.68%，87.14% ± 2.51%，R 组和E组比较，P均＜0.05。

3 讨论

以索拉非尼为代表的肝癌靶向药物理论上具有抗血管生成、抑制细胞增殖以及诱导凋亡的多重抗肿瘤作用，但临床上索拉非尼或同类药物仅针对部分基因型突变患者有效，其中相当一部分患者在用药后不同时间还出现了肿瘤耐药，总体生存期延长有限［8］。对索拉非尼作用机制的进一步探索发现，类似药物可以通过p62-Keap1/NRF2 途径诱导肿瘤细胞合成较多的GSH，同时抑制细胞内脂质过氧化物的蓄积，避免出现脂质过氧化物介导的细胞铁死亡寻找并明确调控HCC 细胞氧化-抗氧化平衡的内在因素，对于揭示肝癌耐药的相关分子机制具有重要意义［9］。

以脯氨酸及其代谢酶为核心的代谢途径是近年来新发现的哺乳动物细胞抗氧化机制［8］。P5CS 是线粒体内合成脯氨酸的关键酶之一，作为谷氨酸合成脯氨酸的第一个催化酶，由ALDH18A1 基因编码，能够将谷氨酸转化为P5C，为脯氨酸提供核心结构——吡咯啉环；其催化活性依赖于ATP 和NAD（P）H［7］。乳腺癌细胞中P5CS 在癌基因c-MYC 的调控下含量升高并促进癌细胞增殖；敲除P5CS的编码基因ALDH18A1 会导致细胞线粒体呼吸链受损，降低细胞对氧化应激的抵抗能力，表明P5CS具有潜在的抗氧化作用，并且都与肿瘤细胞中更多的还原当量相关［7］。本研究发现，相较于癌旁组织和正常肝细胞，HCC 组织中和细胞中P5CS 含量均显著升高，提示P5CS 在HCC 进程中可能具有潜在的促癌作用。

铁死亡是一种以脂质过氧化物累积导致细胞膜结构氧化损伤的细胞死亡方式，现有研究认为，铁死亡的始动环节为铁离子催化下的脂质过氧化物过量合成，同时细胞内抗氧化作用相对不足，导致累积的脂质过氧化物破坏细胞膜结构［3］。可见，铁死亡强调细胞整体的氧化-抗氧化平衡状态；抑制以GSHGPX4 为核心的抗氧化作用，能够显著降低细胞抗氧化能力，使细胞趋向于铁死亡［10］。研究［9，11］发现，结直肠癌和HCC 中P5CS 含量异常升高，而且抑制其基因ALDH18A1 表达后肿瘤细胞均出现了增殖减慢、下游癌基因表达降低。我们进一步分析了P5CS 与肝癌细胞铁死亡的相关性，发现抑制P5CS没有显著影响细胞内脂质过氧化物含量；然而在使用小分子抑制剂Erastin诱导铁死亡后，缺少P5CS的肝癌细胞明显出现铁死亡趋势。由于Erastin 具有诱导铁死亡的特性，某种意义上也具有抗肿瘤效应，因此，上述结果提示P5CS的存在可能保护了肝癌细胞免于药物诱导的铁死亡，赋予了HCC 肿瘤耐药能力。这也是国内外首次将脯氨酸代谢与肿瘤铁死亡联系起来。

脂质过氧化物的产生增多和细胞抗氧化作用的缺失是出现铁死亡的两个核心机制，我们进一步探索了P5CS 与以上两种机制的相关性。细胞内乙酰辅酶A 在乙酰辅酶A 羧化酶的作用下合成多不饱和脂肪酸（PUFA），游离PUFA 经ACSL4 和LPCAT3 两步催化结合磷脂（PL），形成PUFA-PL 并参与构成膜脂质双分子层。然而，PUFA 具有易于过氧化的特点，因此当细胞内LOX-15 增多时，PUFAPL 就会被过氧化为含有过氧自由基的PUFA-PLOOH，对细胞各类膜结构造成氧化损伤［3］。因此，ACSL4、LPCAT3 和LOX-15 通常被认为是铁死亡中调控脂质代谢的关键基因。除了以上脂质过氧化物的异常产生外，以SLC7A11-GSH-GPX4 为核心的抗氧化功能缺失同样是铁死亡的特征［12］。合成GSH 所需三种底物氨基酸之一的半胱氨酸，主要由通道蛋白SLC7A11 逆向转运进入细胞；进一步合成的GSH 在GPX4 催化下氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），同时为细胞提供抗氧化当量。因此，SLC7A11 的逆向转运功能、GSH 的合成以及GPX4的催化功能是细胞抵抗铁死亡的最主要因素［12-13］。本研究发现，抑制P5CS 并不能影响肝癌细胞内脂质过氧化关键基因ACSL4、LPCAT3 和LOX-15 的表达，但能显著降低SLC7A11 及GPX4 的蛋白含量，表明P5CS 并不能影响铁死亡的起始过程，而是通过增强抗氧化能力抑制了细胞铁死亡。为了进一步明确P5CS 发挥抗氧化能力的靶点，我们对比了使用Erastin 或RSL-3 后，肝癌细胞铁死亡的情况。结果显示，两种铁死亡诱导剂均能诱导缺乏P5CS的肝癌细胞铁死亡，但使用RSL-3 后细胞活性降低更为显著、细胞内脂质过氧化物蓄积更为明显，表明P5CS 主要通过维持GPX4 含量阻止了肝癌细胞铁死亡。

综上所述，相比于癌旁组织，HCC 组织中P5CS表达升高。P5CS 可抑制Li-7 及Huh-7 细胞的铁死亡，其机制可能为P5CS 抑制细胞内GPX4 表达，促进肝癌细胞的铁死亡。