多层非均相制剂技术制备固态花青素面膜及其稳定性评价

李和伟 魏国志 许飞飞

[摘要]目的：优化固体花青素面膜多层非均相制备工艺，并考察面膜稳定性。方法：应用Franz透皮试验仪进行透皮试验；应用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）测定固体花青素面膜中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）在猪皮肤表面残留量、皮肤内滞留量和经皮透过量；应用Hunter和全析因实验设计优化工艺变量；应用设计空间确定关键工艺变量的最优值。结果：确定3个关键工艺变量最优值包括面膜中不加入油酸；采用先涂布辅料基质，再涂布花青素原料方式制备；涂布层数为3层。优化工艺后制备的3批面膜长期稳定性显示，C3G在皮肤表面6个月的残留百分率略低于0 d的数据。面膜贴敷20 min去除之后12 h，皮肤表面残留百分率可达8%左右。结论：优化后的多层非均相制备工艺路线可行，制备的固体花青素面膜可长期保存至少6个月。

[关键词]多层非均相制备；固体花青素面膜；皮肤表面残留；实验设计；设计空间

[中图分类号]TQ658.29    [文獻标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）11-0076-06

Preparation of Solid Anthocyanin Facial Mask Using Multilayer Heterogeneity Technology and Its Stability Evaluation

LI Hewei，WEI Guozhi，XU Feifei

（Changzhou Weibo Hi-Tech Co.Ltd.，Changzhou 213000，Jiangsu，China）

Abstract： Objective  To optimize the multilayer heterogeneity process of solid anthocyanin masks and examine the stability of the mask. Methods  Franz diffusion cell was used for the transdermal test， HPLC was used to determine the content of the residual amount on skin surface， retention amount in skin， and percutaneous permeation amount of Cyanidin-3-O-glucoside （C3G） in solid anthocyanin mask. Hunter and full factorial experimental design were used to optimize the process variables， and design space was used to determine the optimal values of the key process variables. Results  The optimal values of 3 key process variables were determined， oleic acid was not added to the mask， the excipient-matrix agents were coated first and then the anthocyanin raw material was coated， the number of coatings was 3 layers. The long-term stability of C3G in the 3 batches of masks prepared after process optimization showed that the residual percentage of C3G on the skin surface for 6 months was slightly lower than the data of 0 d. After the mask was applied for 20 minutes and removed for 12 hours， the residual percentage of C3G on the skin surface could reach about 8%. Conclusion  The optimized multilayer heterogeneity process route is feasible， and the solid anthocyanin mask prepared can be stored for at least 6 months.

Key words： multilayer heterogeneity; solid anthocyanin mask; residual amount on skin surface; experimental design; design space

花青素是一类广泛存在于植物中的天然水溶性色素，属于黄酮类化合物[1]。花青素具有抗氧化、抗衰老和调节糖类代谢等多种生物活性[1]。此外，研究发现花青素中一些成分具有皮肤美白作用。花青素中代表性成分矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside，C3G）可通过抑制酪氨酸酶活性减少皮肤黑色素生成，达到美白皮肤作用[2]。此外，文献报道C3G可以保护皮肤细胞免受紫外线辐射，对皮肤具有较好的抗紫外线辐射作用[3-4]。目前，面膜产品中逐渐开始加入花青素原料，以达到同时实现防紫外线辐射和美白护肤双重功效。

植物花青素加入面膜中需要解决两个主要的难题。一是花青素类成分因其特殊的化学结构导致的稳定性较差，尤其是在pH＞3.0含水环境下，花青素成分容易更快地降解[5]。人类的脸部皮肤pH值范围为4.5～5.5[6]，所以一般常见的半固态面膜pH为5～6。在这种半固态面膜中花青降解较快，面膜产品不易长期保存。二是花青素面膜要实现防紫外线作用，需要花青素类成分从面膜中释放出来后在皮肤表层长时间驻留，否则将难于实现防紫外线作用。

多层非均相制备的核心工艺是来源于制备口腔速崩片的真空冷冻干燥工艺[7]和面膜不同基质多层分布涂布的结合。目前应用真空冷冻干燥技术制备面膜的研究较少[8]，而采用分层涂布冷冻干燥技术制备固体面膜更是鲜有报道。多层非均相制备技术属于一种新型固体面膜制备技术，采用该技术制备的面膜有两个优势：在面膜内部形成多孔的三维结构，有利于面膜中活性成分花青素在短时间快速从面膜中释放；多层非均相制备的固体面膜不同于目前常规的液体面膜，其含水量极低（小于1.0%），可以增加花青素原料在面膜中长期储存的稳定性。

本研究通過多层非均相制备蓝莓花青素固体面膜，功效定位于防紫外线辐射对皮肤损害，期望面膜在贴敷20 min，花青素成分能更多驻留在皮肤表面而非渗透进入皮肤。具体研究过程如下：①建立C3G在皮肤表面残留量、皮肤内滞留量和经皮透过量的含量测定方法并进行方法学验证；②以C3G在皮肤表面残留量、皮肤内滞留量和经皮透过量指标，应用Hunter和完全析因实验设计（Full factorial experimental design，FFED）评估多层非均相制备工艺变量，确定关键工艺变量的最优值；③长期6个月稳定性条件下，测定固体面膜中花青素释放和皮肤透过的稳定性。

1  仪器和材料

1.1 仪器：BSA2202（精度0.01 g）型、CPA225D型（精度0.01 mg）天平（赛多利斯公司）；LC-16型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SPD-16型紫外检测器（日本岛津公司）；TT-B（D）型Franz透皮试验仪（天津市正通科技有限公司）；F6/10型电动匀浆机（上海净信实业发展有限公司）；800D-1型离心机（常州天瑞仪器有限公司）；SHH-150GSD综合药品稳定性试验箱（重庆市永生实验仪器厂）；FiveEasy Plus型pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；BIO-DL型移液枪（赛多利斯公司）。

1.2 材料：蓝莓花青素[欧洲越橘（Vaccinium myrtillus）果提取物，杨凌瑞芬生物科技有限公司]；花青素面膜（WB-HQS-220801/02/03），常州伟博海泰化妆品有限公司研制；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品（纯度：99.5%，坛墨质检科技股份有限公司）；Luna C18色谱柱（pHenomenex公司）；滤膜（0.22μm，天津津腾公司）。

1.3 试剂：色谱纯乙腈（Fisher公司）；实验用水为超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）；生理盐水，95%酒精，磷酸二氢钾，磷酸为分析纯（北京化工集团股份有限公司）。

1.4 实验动物：巴马小型猪[合格证号：SCXK（苏）2022-0013，泰州泰和生物科技有限公司，雄性，日龄30，体重2.5～3.5 kg]。

2  方法

2.1 固态花青素面膜制备方法：将水、甘油、海藻糖、低聚果糖、聚甘油-10油酸酯和角鲨烷混合后高速剪切机内搅拌均匀，得到所需的面膜基质溶液；再将原料欧洲越橘果提取物用少量水溶解和适量甘油混合混匀，得到原料溶液。机器预冻温度-30℃，预冻2 h，隔板温度-15℃，升温速度为4.5℃/h，真空度20 Pa。首先空白膜布快速通过低温区，进行预冻。然后开始制备，涂布时先涂布一层辅料基质再涂布花青素原料，反复涂布3层，每层涂布厚度设置为0.5 mm。

2.2 HPLC测定C3G的含量

2.2.1 色谱条件：色谱柱为C18（4.6 mm×150 mm，3.0μm）；流动相A为87%乙腈∶3%水∶10%甲酸，流动相B为50%乙腈∶40%水∶10%甲酸。梯度洗脱程序：0～20 min，2%～14% A；20～25 min，14% A；25～35 min，14%～30%A；流速0.8 ml/min；柱温30℃，检测波长520 nm；进样量20μl。

2.2.2 对照品溶液制备：精密称取C3G对照品约10 mg，加入2%甲酸-甲醇溶液溶解并定容于10 ml棕色量瓶中，摇匀，即得浓度约为1.0 mg/ml的对照品储备溶液，备用。

2.3 离体猪皮透皮试验

2.3.1 离体猪皮制备：巴马小型猪处死后立即剪取腹部皮肤，剥离皮下脂肪和结缔组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分，备用。

2.3.2 试验步骤：参考文献方法[9-10]，应用Franz透皮试验仪进行透皮试验，转速100 rpm/min，水浴温度37℃ 0.5℃，扩散池暴露皮肤面积为3.14 cm2， 接收池体积为12 ml，接收溶液为pH3.0磷酸盐缓冲液。将面膜剪成3.14 cm2小块，贴敷于皮肤上，固定于接收池上，仪器避开直接暴露在阳光下，开始试验。①皮肤表面残留样品制备：在取样时间点，取下面膜，再用3只棉球分别蘸2%甲酸-甲醇溶液各擦拭皮肤表面3次，然后将这些棉球放在2%甲酸-甲醇溶液中超声提取，冷却至室温，定容置10 ml。②皮肤内滞留样品制备：在取样时间点，先去除皮肤表面残留的面膜（方法同①），然后将皮肤剪碎，在匀浆机内加入10 ml 2%甲酸-甲醇溶液进行匀浆处理，离心，取上清液。③皮下接收液样品制备：取接收液0.5 ml，每次取样后向接收池内补充同体积接收液。所有样品溶液经0.22μm微孔滤膜过滤。

2.4 数据分析

2.4.1 计算皮肤表面C3G的残留和皮肤内C3G滞留百分率，计算公式如下。

公式中Ci（ug·ml-1）表示在2.3.2中不同时间点的①和②中花青素的浓度；Vi（ml）代表提取溶液体积（10 ml）；Mu（μg）是扩散池暴露皮肤面积的面膜中C3G质量。

2.4.2 皮下C3G累积透过百分率计算公式如下[11]。

公式中Cn（μg/ml）代表不同时间点C3G在接收介质中浓度；Vrec（ml）代表接收液体积（12 ml）；Ci（μg/ml）代表在Cn前一个时间点的C3G在接收介质中浓度；Vi（ml）代表取样体积（0.5 ml）。本文Hunter和FFED设计与计算分析均由JMP 11.0.0平台实现（SAS Institute Inc.）。

3  结果

3.1 HPLC测定C3G的含量方法学验证

3.1.1 线性关系考察：用移液枪量取不同体积对照品溶液，再加入2%甲酸-甲醇溶液进行稀释，摇匀，配制成质量浓度分别约为100、50、5、2.5、1.0、0.10μg·ml-1的系列对照品溶液。吸取上述各浓度对照品溶液各20μl依次注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，C3G回归方程为Y-4.34E+04X-8.10E+03，r=0.999 9。结果表明，C3G的线性浓度分别为0.11～105.97μg·ml-1。

3.1.2 精密度试验：取对照品（约5μg·ml-1）溶液20μl，分别于同1天之内连续进样测定6次，并在6 d之内连续进样测定，记录峰面积。结果显示C3G日内和日间精密度RSD分别为2.20%和2.68%。

3.1.3 稳定性试验：精密量3份取供试品溶液（猪皮肤表面残留，猪皮肤内滞留和皮下接收液样品）各20μl，避光放置在室温条件下，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h测定峰面积，结果显示峰面积RSD为2.05%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

3.1.4 回收率试验

3.1.4.1 猪皮肤表面残留测定回收率：取空白巴马小型猪新鲜猪皮3.14 cm2，量取对照品溶液（5μg·ml-1）涂抹于猪皮表面，停留20 min后，加入2%甲酸-甲醇超声，提取2次，每次10.0 ml，合并提取液，5 000 rpm离心10 min，上清液0.22μm滤膜过滤。

3.1.4.2 猪皮肤内滞留测定回收率：将剪碎的猪皮肤中加入对照品溶液（5μg·ml-1），再加入2%甲酸-甲醇超声，按①中提取方法操作。

3.1.4.3 皮下接收液测定回收率：在pH 3.0磷酸盐缓冲液中加入对照品溶液（按1∶1比例）。按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。回收率测定分别为100.3%、99.9%和99.2%，RSD值分别为2.15%、1.12%和2.20%。

3.1.5 专属性试验：取供试品溶液，对照品溶液、阴性样品（空白磷酸接收液和猪皮提取液），按“2.2.1”项下色谱条件检测，记录色谱图。对照品峰形良好，供试品与对照品在相应位置上存在相同峰，且阴性样品溶液对测定结果不产生干扰。

3.2 Hunter试验设计：本研究中初始工艺变量由连续变量和分类变量组成，因此本研究选择Hunter设计。选择20 min时皮肤表面残留百分率（Y1）、皮肤内滞留百分率（Y2）和经皮透过百分率（Y3）为响应值。基于花青素面膜功效，Y1和Y2期望越大越好，Y3期望越小越好。关键工艺变量选择1个物料输入变量因素A（促渗剂油酸含量）1%和3%及8个工艺参数[涂布方式（因素B：三水平分类变量。①先涂原料：先涂布花青素再涂辅料基质；②混合涂：花青素和辅料基质混匀后一起涂布；③原料涂表面：先涂基质，再将花青素原料涂布在基质表面），预冻温度（因素C：-20℃和-40℃），预冻时间（因素D：1 h和3 h），涂布层数（因素E：2层和4层），涂布厚度（因素F：0.5 mm和1.0 mm），隔板温度（因素G：-10℃和-20℃），升温速率（因素H：3℃/h和6℃/h），真空度（因素I：10 Pa和30 Pa）]。Hunter实验结果见表1。

3.3 模型建立：基于最小BIC准则（贝叶斯信息准则），采用逐步回归方法建立模型。输入变量A、工艺参数B和D是Y1和Y3模型的显著性影响因素；输入变量A、工艺参数B、E和F是Y2模型的显著性影响因素（见表2）。结果显示，因素A越小，Y1和Y3越趋近于理想值；因素A越大，Y2越趋近于理想值（见图1A～C）。因素B选择原料涂表面时，Y1达到理想值；因素B选择原料涂表面和混合涂时Y2趋近于理想值；因素B选择先涂原料时Y3达到理想值（见图1D～F）。因素A和B對3个响应的影响趋势不同，因此在后续FFED中，综合评估因素A和B对Y1、Y2和Y3的整体影响，以便确定最估值。尽管因素D对Y3有显著性影响，但相对于其他因素，其影响较小，在后续的FFED研究中，为了减少实验次数，不再细化考察这个因素。对于影响不显著的因素，为了工艺耐用性，均选择中间值作为最终面膜制备的工艺参数。

3.4 FFED设计：选择2 h时皮肤表面残留百分率（Y4）、皮肤内滞留百分率（Y5）和经皮透过百分率（Y6）为响应值。Y4和Y5期望越大越好，Y6期望越小越好。因素A[促渗剂油酸含量（2水平：0%和1%）]、因素B涂布方式（3水平：①花青素涂布于基质表面，L1；②混合涂，L2；③将面膜50%的量混合涂，再将剩余50%量原料涂面于基质表面，L1+L2、因素E（2层和3层）和因素F（0.25 mm和0.5 mm）。FFED设计和结果见表3。应用BIC评估准则，采用逐步回归方法获得Y1，Y2和Y3最优模型项（见表4）。

3.5 设计空间建立：基于Y4、Y5和Y6回归模型，建立设计空间，确定工艺变量最优值。图2中的白色区域即为参数A、B和E的设计空间。3个响应的阈值设定为Y1＞10%，Y2＜10%，Y3＜5%。结果显示，可以确定3个关键工艺变量的可接受范围为：①参数A：0～0.10%（见图2A），最后确定产品中不加入油酸；②参数B：L1和L1+L2两种涂布方式均可（图2A），最后确定采用L1涂布方式；③参数E：涂布2～3层均可（见图2B），最后确定涂布3层；④参数F：影响不显著，确定层厚为0.5 mm。

3.6 花青素面膜稳定性试验结果：按本文研究确定的多层非均相工艺制备3批花青素面膜，长期6个月稳定性测定结果[温度（25±2）℃，相对湿度（60±5）%]，见图3。为了模拟实际面膜贴敷状态，在透皮试验时，面膜贴敷20 min，去除面膜之后，于不同时间点取样测定。数据以3批平均值和相对标准偏差表示。结果表明，2～12 h，长期稳定性6个月C3G的残留百分率和滞留百分率略低于0 d的数据；长期稳定性6个月C3G的经皮透过百分率在12 h略低于0 d的数据，可认为固体花青素面膜样品至少能保存6个月，以C3G为代表的花青素成分可以稳定释放。

4  讨论

C3G不仅是蓝莓花青素中含量较高的成分[12]，而且文献报道C3G具有抗紫外线和皮肤美白的生物活性[2-4]。因此，本研究选择C3G作为花青素面膜中多个花青素成分的代表性指标成分。花青素类成分在pH大于3的溶液中稳定性较差[5]，因此在透皮试验时，将接收液的pH设置为3.0的磷酸盐缓冲液，减少因接收液pH过高导致花青素降解给测定带来的误差。面膜在实际使用中每次的贴敷时间为20 min左右，因此在Hunter试验时，采用面膜贴敷20 min之后，取样测定。

本研究采用多层非均相制备工艺制备固体面膜，该面膜内部形成多孔的三维结构，有利于面膜中花青素的快速释放。从本研究制备的产品可以看出，面膜贴敷20 min，皮肤表面的残留量可达到近15%（见图3A），这显示了固体面膜释放花青素的速度较快。面膜贴敷去除后12 h，皮肤表面残留百分率仍可达8%左右。这表明本研究制备的花青素固体面膜为皮肤抗紫外线功效提供了化学物质基础。油酸作为一种常用的皮肤渗透剂[13]，可大幅度增加面膜中活性成分透过皮肤的能力。本研究也证实了油酸对C3G皮肤透过性的显著性影响，但本研究制备的花青素面膜，不希望以C3G为代表的花青素类成分快速经皮透过进入系统循环，希望花青素能在皮肤表面停留更长时间，以实现抗紫外线功效，因此最后面膜制备中没有加入油酸作为透皮促渗剂。

巴马小型猪皮肤与人类皮肤生理特征最接近，被欧盟委员会和日本医药食品局等多个国际组织推荐代替人类皮膚进行药物体外渗透性研究[14]，也是在众多文献中被广泛使用的皮肤模型[15-16]。目前大多数药物经皮渗透性研究主要是关注药物经皮透过量[16-19]，只有少数文献关注药物在皮肤内的驻留量[20-21]。本研究在以前文献研究基础上，结合面膜中C3G的实际使用功效，在研究中同时关注C3G经皮透过量，皮肤内滞留量和皮肤表面残留量。本研究以Hunter结合FFED作为实验设计方法对影响面膜中C3G在皮肤表面残留量、皮肤内滞留量和经皮透过量的工艺变量进行研究和优化。

本研究的初始工艺参数包括连续和分类两种不同类型的变量，Hunter设计可以同时评估不同类型变量的主效应[22]，这是经典的Plackett-Burman实验设计无法实现的。FFED设计可以确定最佳工艺参数值和参数设计空间，因此，在本研究中，将Hunter和FFED结合来进行工艺参数的优化研究。优化工艺制备的面膜贴敷20 min后，C3G即能较快释放且能长时间驻留到皮肤表面。

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[收稿日期]2023-03-24

本文引用格式：李和伟，魏国志，许飞飞.多层非均相制剂技术制备固态花青素面膜及其稳定性评价[J].中国美容医学，2023，32（11）：76-81.