基于网络药理学探究金果胃康胶囊治疗慢性萎缩性胃炎和胃上皮内瘤变的分子机制

王 医,宋 健,孟凯强,郝 镜,沈舒文,林先佳,赵唯含,景 琛

(1. 陕西中医药大学第一临床医学院,陕西 咸阳 712046;2. 陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712000)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)是临床常见的消化系统疾病,其主要病理特征是胃黏膜固有腺体萎缩,常与肠上皮化生(intestinal metaplasia,IM)和胃上皮内瘤变(gastric intraepithelial neoplasia, GIN)合并。已获广泛认可的胃癌的进展模式为:正常胃黏膜→慢性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→低级别上皮内瘤变→高级别上皮内瘤变→胃癌[1]。因此,积极治疗CAG和GIN是防治胃癌发生的重要策略。

在长期的临床实践中,国家级名老中医沈舒文教授根据胃癌前病变的证候,创造性地提出“毒瘀交阻胃络”为胃癌前病变的核心病机。自拟方金果胃康胶囊由半枝莲、朱砂七、太子参、枸橘组成,治疗胃癌前病变疗效确切、使用安全[2]。本课题组前期对金果胃康胶囊进行实验研究,发现金果胃康胶囊可能通过调控miR-216b/beclin-1信号通路,从而促进细胞自噬,起到保护胃黏膜且治疗胃癌前病变的作用[3],但目前只局限于某一通路或者某一靶点研究金果胃康胶囊治疗胃癌前病变的机制,这与通过多靶点、多通路调节疾病的中药复方机制不符。符合中医药传统理论特点并基于系统药理学的网络药理学,通过整体、系统地观察药物,为研究中药方剂复杂化学体系与病证复杂生物系统的相互作用提供了新的视角和思路[4-6]。因此,本研究借助网络药理学相关数据库,拟开展关于金果胃康胶囊治疗胃癌前病变的基础性研究,旨在探讨金果胃康胶囊在胃炎-癌转化CAG及GIN阶段的潜在活性成分及作用机制,探究金果胃康胶囊在胃癌前病变的分子通路,为其基础研究提供依据。

1 资料与方法

1.1金果胃康胶囊活性化学成分的收集 金果胃康胶囊由半枝莲、太子参、朱砂七、枸橘组成,借助中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、中药综合数据库TCMID(http://www.Megabionet.org/tcmid/)、上海有机所化学数据库及文献检索“半枝莲”“太子参”“黄药子”“枸橘”得到中药化学成分信息。在TCMSP数据库中,参照文献[7],将相关参数设置为:口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%及类药性(drug-likeness, DL)≥0.18,收集符合条件的活性成分,并将多个数据库收集的活性成分进行合并去除重复。

1.2金果胃康胶囊活性成分靶点的预测 通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、化源网(https://www.chemsrc.com/)及查阅文献获得活性成分的化学结构,将其保存为sdf格式,并导入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)中,限定研究对象为人类(Homo sapiens),进行潜在靶点预测,借助Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)对化合物预测靶点名称进行统一规范。

1.3疾病靶点的获取 登陆在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)(https://omim.org/)、GenCards数据库(https://www.genecards.org/),分别以关键词“chronic atrophic gastritis”“gastric intraepithelial neoplasia”检索CAG及GIN的相关蛋白,并分别将各数据库获取的疾病相关蛋白合并去重。

1.4金果胃康胶囊成分-疾病靶点PPI网络构建为明晰金果胃康胶囊药物相关靶点与CAG、GIN靶点间的相互作用,利用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)分别绘制金果胃康胶囊与CAG、GIN相关靶点韦恩图,得到交集靶点。将交集靶点导入STRlNG 11.5平台(https://cn.string-db.org/),蛋白种类设置为“Homo sapiens”进行筛选,构建蛋白-蛋白相互作用PPI网络模型。然后运用cytoscape 3.7.1软件把PPI网络可视化,并利用其内置Network Analyzer插件,得出各节点度(Degree)值,计算其中位数,筛选出大于网络节点度值中位数的关键靶点。

1.5靶点GO和KEGG富集分析 把金果胃康胶囊治疗作用对应的关键靶点基因导入Metascape平台(http://metascape.org/gp/index.html),设置P<0.01,进行GO和KEGG富集分析。根据P值排序,分别筛选前20项KEGG通路和前20项GO功能,借助微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)可视化分析。

1.6金果胃康胶囊成分-靶点-通路网络图的构建 获得交集靶点后,对化合物进行反向筛选,去除靶点中不含交集基因的化合物。将上述金果胃康胶囊的活性成分及其靶标预测结果、作用通路为节点,在Excel表格中建立相互对应关系,然后导入到Cytoscape 3.7.1软件,构建金果胃康胶囊“化合物-靶标-通路”的网络药理图,并通过Network Analyzer插件分析有效成分及靶点节点度(Degree)、中心度(BetweennessCentrality,BB)、紧密度(ClosenessCentrality,CC)等网络拓扑学参数,判断金果胃康胶囊的重要化学成分核心靶蛋白。

1.7金果胃康胶囊中药成分与重要靶点分子对接验证 将1.4项下筛选出的靶点中Degree值排名前五的靶点与1.6项下筛选出的靶点中Degree值排名前五的靶点取交集,将所得靶点作为受体,将1.6项下筛选出的主要成分作为配体,进行分子对接。对接使用的蛋白晶体结构从PDB(https://www.rcsb.org)数据库中下载获得;小分子的3D结构从PubChem数据库下载获得,并在MMFF94力场下进行能量最小化。使用PyMol 2.5去除所有受体水分子、盐离子和小分子。使用PyMol基于晶体配体的位置定义对接盒子的中心,并使对接盒子包裹蛋白活性位点。此外,使用Open Babel 3.1.1(http://openbabel.org/wiki/ Main_Page)将所有处理好后的小分子以及受体蛋白转换为AutoDock Vina 1.1.2对接必需的pdbqt格式。最后采用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接工作,对接时,全局搜索的详尽度设为32,其余参数保持默认设置。最后利用PyMol 2.5对对接结果进行可视化分析。

2 结 果

2.1金果胃康胶囊活性化学成分的收集及靶点预测结果 从TCMSP数据库中共收集到半枝莲29个成分、太子参8个化学成分、朱砂七15个化学成分。由于目前国内外对枸橘的成分研究较少,因此通过确认、校正从TCMID数据库及上海有机所化学数据库中检索得到的成分,并且补充文献报道2次以上的成分,共得到枸橘18个化合物[8-13]。由于TCMSP数据库中未收录枸橘,因此不采用常规的成分筛选指标OB、DL,保留全部成分。结果见表1。

2.2中药活性成分靶点与CAG、GIN相关蛋白的预测结果 从Siwss Target Prediction数据库收集作用靶点,以Probability值为筛选条件,收集金果胃康胶囊作用靶点共251个。从GenCards、OMIM数据库获得CAG疾病靶标787个;获得GIN疾病靶标1 643个。利用韦恩图获得金果胃康胶囊与CAG的交集靶点60个,与GIN交集靶点88个,见图1。随着胃炎-癌转化进程,对应的靶点数量增加。

表1 金果胃康胶囊主要成分

续表

2.3金果胃康胶囊成分-疾病靶点PPI网络 将金果胃康胶囊与CAG、GIN的交集靶点分别导入STRING 11.5数据库进行PPI网络分析,得到蛋白互作网络图,去除游离靶点,利用cytoscape 3.7.1软件将PPI网络可视化,如图2、图3所示,图中节点面积越大、颜色越深表明其对疾病的影响越大。CAG PPI网络包括59个靶蛋白节点,共有529条边,边代表蛋白与蛋白之间的相互作用。由网络拓扑学数据可知化合物的中位度数为15,筛选出度值≥15的关键靶点,推测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子受体(EGFR)、胱天蛋白酶3(CASP3)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)可能是金果胃康胶囊治疗CAG的重要靶点。GIN PPI网络包含87个靶蛋白节点,共有921条边,由网络拓扑学结构数据可知化合物的中位度数为17,筛选出度值≥17的关键靶点,推测雌激素受体1(ESR1)、TNF、AKT1、CASP3、EGFR可能是金果胃康胶囊治疗GIN的重要靶点。金果胃康胶囊治疗CAG、GIN的共有靶点47个,如EGFR、AKTI、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、TNF、CASP3。

图1 金果胃康胶囊-CAG、GIN韦恩图

2.4靶点GO和KEGG富集分析 运用Metascape数据平台对关键靶点进行信号通路分析,根据KEGG功能注释,按P值大小筛选前出20条注释,借助微生信平台绘制气泡图;根据GO功能分析,筛选前20条注释,绘制条形图,如图4所示。KEGG通路富集分析显示,CAG及GIN共有通路137条,例如癌症通路(Pathways in cancer)、蛋白多糖肿瘤通路(Proteoglycans in cancer)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、内分泌抵抗(Endocrine resistance)、人巨细胞感染(Human cytomegalovirus infection)、微小核糖核酸肿瘤通路(MicroRNAs in cancer)等。CAG及GIN共同参与的生物学过程为蛋白磷酸化(protein phosphorylation)、激酶活性的调节(regulation of kinase activity)、细胞迁移正向调节(positive regulation of cell migration)等。随着疾病的进展,金果胃康胶囊在胃炎-癌转化过程中,涉及的生物学过程明显增加,且金果胃康胶囊参与治疗疾病的通路增加。

图2 金果胃康胶囊-CAG靶点PPI网络

图3 金果胃康胶囊-GIN靶点PPI网络

2.5金果胃康胶囊成分-靶点-通路网络图 借助Cytoscape 3.7.1构建金果胃康胶囊成分-靶点-通路网络图,如图5所示,通过Network Analyzer插件对图5进行网络拓扑分析,获得核心成分及核心作用靶点。金果胃康胶囊治疗CAG、GIN的共同活性成分多达40种,其中山奈酚(Kaempferol)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)等为主要成分,见表2。金果胃康胶囊对CAG、GIN的共同作用靶点有26个,其中EGFR、AKT1等为主要靶点,见表3。图5表明,半枝莲、朱砂七包含作用于CAG及GIN阶段的癌症通路及蛋白多糖肿瘤通路中的单体和化合物多,表明两味中药,尤其是半枝莲的增减可能对金果胃康胶囊的有效性影响较大,可为之后的临床用药提供参考。如表4所示,在CAG及GIN阶段,金果胃康胶囊的核心通路均为癌症通路、蛋白多糖肿瘤通路及人巨细胞病毒感染等,与根据P值筛选的KEGG所得CAG及GIN相关通路结果相似,随着疾病的进展,Degree值增加,表明金果胃康胶囊对疾病的影响增加。

注:A:CAG GO BP分析;B:CAG KEGG分析;C:GIN GO BP分析;D:GIN KEGG分析

表2 金果胃康胶囊主要活性成分网络节点特征参数

表3 金果胃康胶囊主要活性成分靶点网络节点特征参数

表4 金果胃康胶囊主要活性成分通路网络节点特征参数

2.6分子对接验证 对接模拟技术是探究小分子与目标靶点相互作用的便捷有效手段。通过筛选,在CAG阶段,将EGFR、AKT1分别与Kaempferol、 Quercetin、柠檬苦素(Limonin)、 Luteolin对接;在GIN阶段,将EGFR与Kaempferol、Quercetin、Luteolin、5-羟基-7,8-二甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)色原酮[5-hydroxy-7,8-dimethoxy-2-(4-methoxyphenyl)chromone]对接。如图6所示。通过

注:A:CAG通路网络图;B:GIN通路网络图

PDB平台获取对接靶点的PDB ID:EGFR(PDBID:6VH4)、AKT1(PDBID:6S9W)。部分靶标蛋白对接分数平均值见表5。使用AutoDock Vina 1.1.2软件对化合物与各个目标蛋白进行对接研究。如表所示,结合亲和力为负数表示存在结合的可能,通常数值小于-6 kcal/mol被认为结合可能性较大。如表5所示,可知所有分子与靶蛋白的结合亲和力都低于-6 kcal/mol,意味着它们之间结合效果较好。AKT1-Luteolin、AKT1-Limonin、AKT1-Quercetin以及EGFR-Limonin结合能在-9.5 kcal/mol以下。分子对接结果表明,山奈酚、槲皮素、柠檬苦素、木犀草素可能是金果胃康胶囊治疗CAG过程中发挥疗效的关键成分;山奈酚、槲皮素、木犀草素、5-羟基-7,8-二甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)色原酮可能是金果胃康胶囊治疗GIN的关键成分。分子对接结果可以为今后进一步开展复方研究提供数据支撑。

3 讨 论

表5 部分靶标蛋白对接分数平均值

胃癌的发病率和病死率居世界恶性肿瘤的第2位[14],对人类健康构成严重威胁。胃癌前病变演变至胃癌需要相对较长的时间,因此,如果能对胃癌前病变进行有效的干预,胃癌的发生率与病死率将会大大降低。目前,临床尚无治疗胃癌前病变的特异性药物,而中医药以其个体化治疗对胃癌前病变效果显著[15]。胃癌前病变属中医胃痞、胃脘痛等病证范畴。沈舒文教授认为“毒瘀交阻,气阴两虚”为本病的常见证候之一,自拟复方金果胃康胶囊具有散热解毒、化瘀益气的功效。方中君药枸橘长于理气散结,其性辛苦,善治胃胀胃痛,有研究表明枸橘中所含的枸橘苷对胃癌细胞有抑制作用[16]。半枝莲作为臣药具有清热解毒、活血化瘀的功效,主要针对胃络瘀血。臣药朱砂七,又名黄药子,性苦寒,具有清热解毒、散瘀止痛的功效,可增强本方治胃痛的效果。

金果胃康胶囊治疗CAG的有效成分与治疗GIN的有效成分多有重合,随着疾病的进展,治疗GIN的有效成分增多,且增多部分的有效成分主要来自半枝莲。提示在临床应用上,在GIN阶段的患者半枝莲用量可适当增加。金果胃康胶囊治疗CAG及GIN的有效成分主要是山柰酚、槲皮素、木犀草素,属黄酮类化合物。现代药理学研究表明黄酮类化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理活性,该化合物将在药品开发领域具有广阔应用前景[17-18]。有研究发现随着山奈酚干预浓度的升高,胃癌细胞中P53基因表达水平显著提高,PARP1表达水平逐渐降低,胃癌细胞凋亡数目逐渐增加,从而抑制胃癌细胞的增殖[19]。同时,通过抑制细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)通路、PI3K-AKT通路,山柰酚可诱导胃癌细胞凋亡[20],但对正常的胃细胞无显著影响。同属黄酮类化合物的槲皮素,能使胃上皮GES-1细胞免受氧化损伤,从而发挥胃保护作用[21]。任虹等[22]研究发现槲皮素可通过作用于表皮生长因子受体抑制肿瘤细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9的分泌,从而抑制肿瘤细胞侵袭。耿威等[23]研究发现,槲皮素可通过激活Cav-1蛋白的表达来抑制胃癌细胞增殖和侵袭。有研究发现木犀草素主要是通过PI3K/AKT等信号通路抑制胃癌细胞的形成及促进胃癌细胞的凋亡[24]。陆雪莹等[25]通过实验研究发现木犀草素可以调节免疫功能,同时下调生长因子A(VEGR-A)和MMP-9的表达对胃癌移植瘤起抑制作用。在CAG及GIN阶段,山柰酚及槲皮素对应的靶点最多,二者主要来源于朱砂七及半枝莲,分子对接结果表明山柰酚、槲皮素与主要靶点EGFR、AKT1结合性强,所以预测二者为本方治疗CAG、GIN的主要作用成分。

通过1.4项及1.6项的筛选,发现金果胃康胶囊治疗CAG的靶点是EGFR、AKT1、TNF、MMP-9;治疗GIN的靶点是EGFR、AKT1、TNF。随着疾病的进展,金果胃康胶囊治疗GIN的靶点明显增加,表明金果胃康胶囊可能对GIN的治疗效果更好。表皮生长因子(EGF)对胃黏膜具有保护作用,研究发现胃长期炎症状态可使其受体EGFR过表达,一旦EGFR与EGF结合,细胞异常分裂导致肠化、异型增生、胃癌,所以目前认为CAG的发展与EGFR的过表达相关[26-27]。EGFR属受体络氨酸激酶(receptors tyrosine kinase, RTKs)家族,在胃腺癌中可呈现出不同程度的表达,亦有实验显示RTKs抑制剂可以抑制肿瘤细胞的生长[28-29]。作为PI3K和AKT蛋白的下游抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL,其异常表达可导致恶性肿瘤的发生、发展,而这一过程是通过二聚化后的EGFR刺激Ras蛋白导致磷酸化级联反应实现[30-31]。EGFR与AKT1可通过EGFR/PI3K/Akt信号通路联结,共同发挥抑制肿瘤发生、发展的作用。TNF是一种多功能细胞因子,其功能的多态性可明显增加胃癌或者慢性萎缩性胃炎的发生风险[32]。已有研究表明胃恶性肿瘤患者血清TNF浓度较正常人群高,在胃癌组织中TNF-αmRNA的转录会明显增加[33]。有研究发现,细胞外基质降解和肿瘤细胞基膜的突破是肿瘤浸润转移的主要原因,而MMP-9是细胞外基质降解中最关键的蛋白水解酶,所以MMP-9与肿瘤形成密切相关。

注：基于对接获得的小分子-蛋白结合模式,图中青色stick为小分子,蓝色cartoon为蛋白,绿色虚线表示pipi-共轭作用,蓝色线表示氢键作用,灰色虚线表示疏水作用。a:AKT1-Kaempferol;b:AKT1-Limonin;c:AKTI-Luteolin;d:AKT1-Quercetin;e:EGFR-5-hydroxy-7,8-dimethoxy-2-(4-methoxy-phenyl)chromone;f:EGFR-Kaempferol;g:EGFR-Limonin;h:EGFR-Luteolin;i:EGFR-Quercetin

通过GO功能富集分析可知,金果胃康胶囊主要是通过酶活性的调节、蛋白磷酸化、细胞迁移正向调节等生物过程,生物调节、新陈代谢、繁殖过程等生物学模式来治疗CAG及GIN。且金果胃康胶囊治疗CAG及GIN阶段的生物过程、信号通路也极为相似,推断金果胃康胶囊治疗CAG及GIN 阶段的作用机制相似。在CAG及GIN阶段,KEGG信号通路分析主要富集通路为癌症通路、蛋白多糖肿瘤通路、内分泌抵抗、PI3K-Akt信号通路、人巨细胞感染等。其中以癌症通路及蛋白多糖肿瘤通路与相关靶点的关系最为密切,由此可推测金果胃康胶囊可能主要通过以上2条通路发挥治疗作用。此外,PI3K-Akt信号通路为细胞内信号传导途径,活化后可以抑制多种刺激,从而诱发胃癌细胞凋亡,促进细胞周期进展、血管生成和转移[34]。徐江江等[35]通过实验得出,异常激活PI3K/AKt信号通路可能导致其在胃癌干细胞中的高表达,进而引起胃癌的发生。有研究表明,P13K-Akt信号通路与CAG的发生发展有着密切关系,其作用机制为:上调NF-κB、TNF-α、JNK等促炎因子表达水平,加重炎症反应,进一步损伤胃黏膜[36],致使胃炎—癌转化。而金果胃康胶囊发挥作用的内分泌抵抗途径,则是由作为人体最大内分泌器官的消化系统实现的。胃肠激素调控胃肠道功能是通过内分泌途径及腔分泌等途径实现的[37]。大量的实验研究表明,胃泌素能显著促进胃肠道黏膜细胞和某些恶性肿瘤细胞的生长[38-39]。已有研究证明,人巨细胞病毒DNA在胃癌组织中的阳性率明显高于癌旁健康组织[40-41],后续关于金果胃康胶囊治疗胃癌前病变的研究可重点围绕人巨细胞病毒感染展开。

综上,CAG与GIN均属胃癌前病变,GIN是CAG进一步发展,且CAG往往伴有GIN。随着疾病的进展,金果胃康胶囊治疗GIN的靶点及有效成分显著多于CAG阶段,提示金果胃康胶囊治疗GIN优于CAG,增多部分的有效成分主要来自于半枝莲及朱砂七,提示在临床应用上,随着疾病的进展,可适量增加半枝莲及朱砂七的用量。根据网络药理学筛选结果,提示在CAG与GIN阶段,金果胃康胶囊发挥治疗作用的主要成分、作用靶点及作用通路较为相似,说明金果胃康胶囊作用于CAG、GIN的作用机制相似。金果胃康胶囊治疗CAG、GIN的可能机制是:①通过下调AKT1、CASP3水平,下调促炎因子MMP-9的水平,抑制TNF炎性因子的表达,抑制EGFR的过表达,从而减少炎症对胃黏膜的刺激和抑制肿瘤细胞的生长、增殖;②抑制癌症通路、蛋白多糖肿瘤通路,并且抑制PI3K-Akt信号通路过度激活来抑制下游抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达,抑制恶性肿瘤的发生、发展。本研究从网络药理学角度所发现的金果胃康胶囊相关通路及靶点可为该方今后的探讨提供理论支撑,但需要后续相关实验验证。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。