基于“脾藏肌肉之气”理论探讨线粒体自噬与重症肌无力的相关性

钟慧雅,蔡东红,陈桐楷,宋雅芳,李岚其,柯铃铃

(广州中医药大学,广东 广州 510405)

重症肌无力主要是神经肌肉接头处传递功能障碍引起的自身免疫性疾病。该病临床表现是部分或全身骨骼肌无力和易疲劳,程度从轻度眼部症状到呼吸功能不全,重症肌无力相关合并症发生率及重症肌无力危象病死率较高,病情容易反复,迁延不愈。目前西医对重症肌无力的治疗主要包括胆碱酯酶抑制剂、免疫抑制剂、胸腺切除术和单抗药物如依库珠单抗、利妥昔单抗[1]。中国重症肌无力发病率估计为(1.55～3.66)/10万,而我国南方的重症肌无力发病率为(2.19～11.07)/10万,女性患病率高于男性,平均每次住院费用为2 526～2 673美元[2]。重症肌无力病程长、病情反复,对患者生活造成极大影响并给家庭带来沉重经济负担。

中医学虽无重症肌无力病名,但重症肌无力的不同临床表现可对应中医的不同证型,如单纯眼肌型中眼外肌麻痹出现眼睑无力、下垂为“睑废”,出现复视为“视岐”;咽喉肌受累出现饮水呛咳、吞咽困难属“喑痱”;四肢肌无力为“痿证”;发生重症肌无力危象出现呼吸困难为“大气下陷”等[3]。《素问·痿论》 曰“脾主身之肌肉”,《灵枢·本神》有“脾气虚则四肢不用”的记载。脾为后天之本主运化,是维持机体功能活动的基础。营卫二气皆赖脾胃运化的水谷精微化生而成,可营养全身五脏六腑、四肢百骸。《证治准绳》亦云:“痿者,气之软弱也,肢体沉重而瘦弱难行也。”线粒体是肌肉能量的来源,通常被称为细胞的“发电站”,骨骼肌运动的正常功能依赖于线粒体的结构与功能的正常与否。维持最佳线粒体含量和功能对骨骼肌健康至关重要,线粒体功能的维持依赖于线粒体生物发生过程和线粒体质量控制过程的平衡,线粒体自噬在线粒体质量控制中起着重要的作用[4]。通过线粒体自噬去除功能障碍的线粒体以达到维持骨骼肌良好的运动功能[5]。线粒体自噬及其调控分子机制的相关研究已成为学者们的关注热点,但是有关脾虚证、重症肌无力及线粒体自噬调控的分子机制三者之间相关性的研究仍较少。因此,本文将基于“脾藏肌肉之气”理论探讨线粒体自噬与重症肌无力的相关性,以期进一步阐明健脾益气法治疗重症肌无力的作用机制。

1 “脾藏肌肉之气”理论

1.1脾主肌肉 “脾藏肌肉之气”理论源于《素问·平人气象论篇》:“脏真濡于脾,脾藏肌肉之气也。”脾主后天之本,为气血化生之源,濡润周身脏腑、四肢百骸。《素问·痿论篇》中记载“脾主身之肌肉”,《素问·五脏生成篇》云“脾之合肉也”。脾主肌肉是指脾通过将水谷化为精微,化生气血,并运送布散到肌肉之中,以营养肌肉,提供肌肉活动所需的能量,使肌肉丰满发达,壮实有力,以维持肌肉的正常功能。《素问·脏气法时论》曰:“脾病者,身重,善饥肉痿,足不收,行善瘈 ,脚下痛。”《素问·气交变大论》曰:“其眚四维,其脏脾,其病内舍心腹,外在肌肉四肢。”若脾气虚衰,主运化功能失职,水谷精微生成或转运障碍,四肢、肌肉失去滋养,则肌肉消瘦、痿软,四肢无力,甚则痿废不用。肌肉的壮实和运动功能与脾密切相关。

1.2脾主营卫之气与痿证密切相关 《灵枢·营卫生会》云:“人受气于谷,谷入于胃,以传与肺,五脏六腑,皆以受气,其清者为营,浊者为卫,营在脉中,卫在脉外,营周不休,五十而复大会,阴阳相贯,如环无端。”营卫二气因阴阳性质的不同一分为二。性质清者为营,性质属阴,行于脉中;性质浊者为卫,性质属阳,行于脉外。二者共同环绕人体周身,分布于五脏六腑、四肢百骸,是人体生命活动重要的物质与功能基础。《素问·痹论篇》载:“荣者,水谷之精气也,和调于五脏,洒陈于六腑,乃能入于脉也,故循脉上下,贯五脏络六腑也。卫者,水谷之悍气也,其气剽疾滑利,不能入于脉也,故循皮肤之中,分肉之间,熏于肓膜,散于胸腹。”营卫二气皆是中焦脾胃运化生成的水谷精微之气,是人体生命所不可缺少的。营气为水谷精微之精华部分,行于脉中,贯通于五脏,营养于六腑,又联络于六腑,具有柔和地滋养、濡润人体五脏六腑、全身百骸的作用。卫气为水谷精微之剽悍部分,其性剽悍滑疾,循行脉外,具有充养、防御、温煦周身的作用。脾藏肌肉之气,可见脾不仅可以直接濡养肌肉,亦可通过调节布散于肌肉的营卫之气,以达到充养肌肉、维持其运动功能的目的。见图1。

图1 脾-营卫二气-肌肉之间关系

营卫之气与痿证发生发展密切相关。邪从皮毛而入,温热湿邪毒侵袭,可致肺热叶焦,经脉阻滞,肌肉不仁,而发痿证。《素问·六节藏象论篇》记载:“肺者……其华在毛,其充在皮。”皮肤毛孔之开阖为卫气所管,卫气和则开适度、内外调达、邪不能害、分肉解利、腠理致密。”卫气是机体正气的重要组成部分,有防御作用,行于外可温养、护卫肌表,防邪气入侵;行于内可温养、保护脏腑、四末,保障正常生理功能[6]。卫气和则腠理致密,可壮实肌肉以抵御外邪。久病生瘀,瘀血阻滞经脉,经脉失于濡养,四肢不得滋养发为痿。营在脉中,气行则血行,营气和则瘀血通。营气循经而行,随血流运行至全身各处,内荣于五脏六腑而外荣养于四末,流注于四肢肌肉,起到滋润、濡养的作用,为肌肉维持生理功能提供营养物质。有学者提出“营卫痿证模型”,认为痿证发生本在营卫[7]。另有学者认为“治痿独取阳明”是通过针刺阳明经腧穴、施以补泻手法以调营卫之气,从而起到治疗痿证的作用[8]。

2 线粒体自噬的内涵

2.1自噬与线粒体自噬概述 自噬是真核生物细胞通过溶酶体,处理过剩、衰老、受损蛋白质、蛋白质复合物、细胞器,进行分解和回收的过程,是使细胞能更好地适应环境变化如缺氧、氧化应激、炎症刺激等和维持稳态的一种细胞保护性程序。自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。线粒体是细胞生命活动的“动力站”,是细胞进行有氧呼吸的主要场所,通过三羧酸循环等方式进行三大营养物质糖、脂肪、蛋白质的能量代谢,产生机体可直接利用的能量载体 ATP,为细胞生命活动提供能量物质。Lemasters[9]在 2005 年首次提出“线粒体自噬”的概念。线粒体自噬属于巨自噬的一种,通过自噬能选择性地清除功能障碍或不需要的线粒体,从而维持细胞内线粒体的质量和数量的平衡,对维持细胞的稳态具有重要意义。线粒体是动态的细胞器,存在于不断融合和分裂高度互连的网络中[10]。线粒体的融合和分裂受到严格的调控,通过消除和防止受损线粒体的积累来维持健康的线粒体群体是必要的。维持功能良好的线粒体群体需要线粒体自噬来调控。

2.2基于PINK1/Parkin的线粒体自噬经典调控机制 近年来,线粒体自噬的分子机制以及相应调控机制的研究引起广大学者的关注。目前在哺乳动物体内已发现多种线粒体自噬途径,其中PINK1-Parkin介导的线粒体自噬信号通路研究较为成熟,也发现了通过B淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)、Nip样蛋白(NIX/BNIP3L)和FUN14结构域蛋白1(FUNDC1)等有自噬微管相关蛋白轻链3 (LC3)结合结构域(LIR)的线粒体外膜蛋白直接与 LC3 相结合发挥作用介导的线粒体自噬信号通路。

Parkin是胞质的E3泛素-蛋白连接酶,可以启动受损的线粒体进行自噬程序。PINK1是丝氨酸/苏氨酸激酶,能磷酸化Parkin和泛素(Ub)。PINK1位于Parkin的上游,可促进Parkin由细胞质到线粒体的转位和线粒体自噬。在线粒体健康的细胞中,PINK1水平较低,因PINK1移位后,PINK1的跨膜片段被释放到胞质溶胶中,并很快被一个N端规则泛素连接酶快速泛素化并通过蛋白酶体降解[11]。当线粒体受损或线粒体膜电势丢失时,PINK1切割降解被阻断,导致积累的PINK1的定位在线粒体外膜上。PINK1募集胞质中的Parkin转位到受损的线粒体外膜表面,并可通过磷酸化Parkin泛素样(UBL)结构域直接激活,活化的PINK1磷酸化并激活Parkin的E3泛素-蛋白连接酶活性[12]。因Parkin 的E3泛素-蛋白连接酶活性,同时将泛素连接到位于线粒体的底物上,引起膜上蛋白泛素化。其中Parkin介导的泛素化有助于自噬相关蛋白TAX1BP1、NDP52、OPTN、NBR1和p62/SQSTM1等具有泛素结合结构域(UBD)的蛋白[13-14]识别并结合线粒体上的泛素化蛋白,并利用泛素化蛋白的LIR与LC3相互作用,与自噬体膜结合,受损线粒体被自噬体吞噬, 最终在溶酶体中降解,完成受损线粒体的自噬(见图2)。LC3分为Ⅰ型和Ⅱ型,通常LC3在细胞质中以LC3-Ⅰ的形式存在,自噬发生时LC3-Ⅰ的一部分转化为膜结合的LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ的量与自噬体形成程度成正比[15],可通过检测LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值了解自噬程度。

2.3线粒体自噬与重症肌无力等神经肌肉病的关系 线粒体是维持骨骼肌功能正常的关键细胞器,线粒体在重症肌无力的发病机制中起着重要作用[16]。线粒体的生物发生和通过线粒体自噬的选择性降解及整合对保持肌肉健康至关重要,这些平衡的破坏可能导致肌肉生物能学的改变和肌肉质量和功能的损失[17]。Parkin是参与线粒体质量控制的关键因素,不仅通过促进受损线粒体的分裂,也通过促进线粒体融合蛋白的降解来抑制受损线粒体的融合来维持线粒体网的质量,Parkin的缺失可致骨骼肌线粒体功能障碍、骨骼肌萎缩[18]。研究表明[19],Parkin基因的敲除导致骨骼肌肌纤维收缩损伤和线粒体功能的严重受损,Parkin对于维持骨骼肌中正常的线粒体功能是必不可少的。PINK1基因敲除的大鼠存在调节运动的黑质神经元进行性变性,多巴胺能神经元减少,伴有握力下降及运动功能协调障碍[20]。在肌萎缩侧索硬化症(ALS)中,发现运动神经元及其调控的神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)发生病理改变,而线粒体自噬对于维持神经肌肉接头功能有重要作用[21-22]。线粒体功能障碍在杜氏肌营养不良(DMD)肌肉受损前发生,提示其可能为杜氏肌营养不良的病理因素[23]。在DMD动物模型及DMD患者的骨骼肌中,参与线粒体自噬的相关基因PINK1、PARK2、BNIP3表达显著降低,线粒体自噬功能受损,导致线粒体功能障碍[24]。Wang等[25]研究发现,MG患者的调节性T细胞(CD4+CD25+T,Tregs)可能存在线粒体自噬小体成熟障碍,线粒体自噬减少,自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达降低。阳玉洁等[26]发现重症肌无力患者外周血调节性T细胞(Tregs)线粒体受损细胞比例较正常对照组明显增高。与MG组比较,加入线粒体自噬激活剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)的MG组受损线粒体减少,而使用线粒体自噬抑制剂环孢素(CsA)培养的MG组则显示Tregs能量代谢紊乱加剧,受损线粒体增加。

图2 PINK1/Parkin通路介导线粒体自噬过程示意图

3 基于线粒体自噬对中医“脾-线粒体相关”的再认识

脾为后天之本、气血生化之源,脾主运化,化气生血,布散水谷精微、津液,以滋润、濡养五脏六腑、四肢百骸,供给机体生命活动所需的物质及能量。脾气充足、脾阳旺盛,则运化功能正常,供能充足,各司其职。线粒体是细胞内进行能量合成的细胞器,能量转化、三羧酸循环和氧化磷酸化等在其内进行。线粒体是单个细胞乃至整个生命体进行需氧、需能活动的枢纽和核心。脾气充足,运化生成能量物质与线粒体供能的功能不谋而合。

现代研究发现,正常大鼠海马神经元中线粒体在电镜下可观察到明显的自噬现象,而脾虚大鼠的线粒体存在嵴减少和空泡化,并且自噬现象较少,PINK1、Parkin和LC3-Ⅱ蛋白表达下降和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低[27]。脾气虚时大鼠的海马神经元线粒体的稳态受到损害,自噬水平下降,可导致海马对胃肠道的调控能力减弱[28],影响胃肠道的消化吸收功能。脾虚证的大鼠海马神经元中的线粒体的能量代谢障碍,海马神经元损伤可影响脾主运化的功能,使脾虚者更虚。此外,有研究发现,脾气虚时大鼠胃黏膜细胞线粒体的膜电位下降,且线粒体中的PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ蛋白表达低于正常大鼠,而p62蛋白表达上升,可见脾气虚证的大鼠胃黏膜细胞的线粒体自噬平衡受到破坏,自噬水平降低,其PINK1-Parkin自噬通路受到一定的抑制,导致线粒体内嵴明显减少和ATP合成减少,提示脾虚证伴随着线粒体的失衡[29]。线粒体质量控制与线粒体自噬密不可分,亦与脾主运化紧密相关。脾气虚时,线粒体自噬稳态被打破,线粒体自噬能力的下降,使线粒体能量代谢障碍,为机体供能不足,可致机体功能失调。

4 健脾益气法是调控脾虚重症肌无力线粒体自噬的有效治法

《素问·太阴阳明论篇》曰:“四肢皆禀气于胃,而不得至经,必因于脾,乃得禀也。”四肢需要得到从胃受纳、腐熟水谷化生的水谷精微之气的营养,但是精微之气不能直接达于四肢,依赖于脾气的运化作用才能使四肢得到水谷精微之气的滋养、气血津液之气的濡养、营卫之气的温养。脾虚则运化不能,在线粒体可表现为线粒体生物合成功能失调、线粒体自噬水平低下,四肢乏源则失用。

Wu等[30]发现四君子汤可能通过提高线粒体呼吸链酶活性和线粒体ATP含量对自身免疫性重症肌无力大鼠腓肠肌线粒体和神经肌肉接头处超微结构有修复作用,且实验结果显示四君子汤疗效优于强的松。课题组前期研究发现,经高剂量健脾益气方药强肌健力方干预后,实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠骨骼肌中线粒体融合分裂相关基因Mfn1、OPA1、Drp1、Fis1的mRNA及蛋白表达较模型组EAMG大鼠显著升高,可在一定程度上修复EAMG大鼠骨骼肌肌原纤维和线粒体的结构,恢复线粒体呼吸链复合体Ⅰ～Ⅳ酶活性,并且可能通过激活AMPK/PGC-1α信号通路,促进线粒体生物合成发生,从而改善MG的症状[31-32]。亦有研究发现,与正常大鼠相比,EAMG大鼠骨骼肌线粒体的ATP 酶活性明显降低,骨骼肌损伤明显,经强的松及葛根及其配伍复方治疗后均可在一定程度上修复骨骼肌,提高ATP酶活性及促进肌肉生成调控因子如成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)和胰岛素样生长因子(IGFs)的表达,以健脾益气、祛湿活血的葛芪参妙组 (葛根、黄芪、丹参和四妙散)改善最为明显[33-34]。

黄琳文等[35]运用网络药理学挖掘了补中益气汤通过多靶点、多通路治疗MG,主要涉及调节活性氧代谢过程、DNA 结合转录因子活性调节、脂多糖反应等生物过程。徐鹏等[36]运用文献数据挖掘发现中医药治疗MG多以补虚为主,兼以清热、祛湿、解毒为法,组方核心为补中益气汤。临床研究发现岭南地区的重症肌无力患者皆以脾虚证为主,伴随湿热证、肾阴虚或肾阳虚,主要治法为健脾益气补虚,用药皆以补中益气汤为基础加减,重用健脾补气药[37]。针刺“足三里”穴位可治疗胃肠病证、下肢痿痹、虚劳诸证等,董佳梓等[38]发现针刺强壮保健要穴“足三里”,可上调LC3-Ⅱ/Ⅰ,有效提高脾虚证大鼠骨骼肌线粒体自噬能力,起到健脾益气、强肌健力的作用。

健脾益气治法中方药乃至穴位针灸可促进线粒体自噬清除“废物”,线粒体在缺氧、氧化应激、炎症刺激等情况下,通过诱导线粒体自噬清除受损的线粒体,保障线粒体的结构和功能的正常,以保障对肌肉的供能,维持四肢肌肉的正常运动功能。

5 展 望

线粒体自噬能选择性地有效清除功能障碍或不需要的线粒体,对维持线粒体及细胞的稳态具有重要意义。脾虚是重症肌无力发生发展的重要病机,线粒体自噬稳态失衡亦是重症肌无力发生发展的重要表现。健脾益气法通过调控线粒体自噬,保障线粒体功能,是治疗重症肌无力的有效治法。本文通过探讨中医理论“脾藏肌肉之气”、线粒体自噬与疑难病重症肌无力的关系,将传统中医理论与现代科学研究相结合,深入阐明健脾益气法治疗重症肌无力的科学内涵,为中医药治疗神经肌肉病提供了新方向。基于线粒体自噬探讨健脾益气法治疗重症肌无力具有重要的科学价值,其中介导线粒体自噬所涉及的相关信号通路及其调控机制仍是未来研究聚焦的重点和难点。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。