烙灸疗法对大鼠脊髓损伤后神经修复及Wnt信号通路的影响

马文欣,刘 畅,虎 娜,海小明,刘自钰,夏 铂

(宁夏医科大学,宁夏 银川 750000)

脊髓损伤是一种破坏性中枢神经损伤,可导致主要的运动、感觉和自主神经功能障碍[1]。脊髓损伤可分为原发性和继发性,脊髓因外力而挫伤、撕裂或因血管损伤而出现神经损伤通常称为原发性损伤。原发性损伤发生后,大量神经细胞死亡,血-脊髓屏障被破坏,随后发生一系列损伤反应,如血管痉挛出血、活性氧形成、脂质过氧化、炎症反应、凋亡等,导致二次级联反应,进一步加重损伤[2-3]。目前治疗脊髓损伤的方法主要有手术治疗、药物治疗、高压氧治疗和物理治疗,但治疗效果和预后均不佳。中医内治法用于脊髓损伤的治疗研究显示可促进神经功能恢复,改善患者肢体运动功能[4]。中医外治法烙灸疗法是一种治疗脊髓损伤的新型疗法,该疗法通过刺激脊髓周围的神经,加强其与大脑中枢神经系统之间的联系,激活脊髓组织的愈合和保护机制,从而促进脊髓损伤大鼠后肢运动和感觉功能的恢复[5-6],但其作用机制仍有待明确。研究发现,作为中枢神经系统重要的信号通路之一,Wnt信号通路不仅参与了神经元突触的形成、血管再生和维持血脑屏障的完整性等多种生理功能[7],还可能在一些成年组织(包括脊髓)的稳态和疾病进展中起着至关重要的作用[8]。当Wnt信号通路激活时,通过促进脊髓损伤后的前后轴突活化再生,从而缓解神经损伤[9]。因此本研究通过观察烙灸疗法对脊髓损伤大鼠Wnt信号通路的影响,以期为临床上烙灸疗法治疗脊髓损伤提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级成年雄性SD大鼠60只,体重230～280 g,由宁夏医科大学实验动物中心提供,动物生产许可证号:SCXK(宁)2020-0001。大鼠在安静环境下饲养,给予充足饲料和饮用水,室温20～22 ℃,相对湿度约45%,保持动物房内昼夜节律。实验过程符合宁夏医科大学伦理委员会标准(IACUC-NYLAC-2021-004)。

1.2主要试剂与仪器 巢蛋白(Nestin)抗体(DF7754,Affinity),神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(#80788,Cell Signaling Technology),黏附连接蛋白(β-catenin)抗体(#8480),糖原合成激酶-3(GSK-3β)抗体(#12456,Cell Signaling Technology);端锚聚合酶抑制剂 (IWR-1,HY-12238,MCE,美国);脊髓打击器(型号:68097,深圳市瑞沃德生命科技有限公司),光学显微镜 (LEICA,德国),Image-lab图像分析系统和Image-Pro图像分析系统(BIORADHERCULES,美国),石蜡切片机(RM2235,德国Leica公司),全波长酶标仪(Epoch,BioTek公司,美国)。

1.3实验方法 将60只大鼠随机分为假手术组、模型组、烙灸组、西药组、Wnt抑制剂组和Wnt抑制剂+烙灸组,每组10只。假手术组大鼠麻醉后打开T9椎板再逐层缝合,其余组大鼠采用撞击T9椎板方法建立脊髓损伤模型。具体造模参照文献[10]实验方法:采用1%戊巴比妥钠(20 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后将其俯卧位固定于手术台上,备皮消毒,以T11椎体棘突作为定位标志,行背正中切口,切开皮肤,钝性剥离肌肉,暴露T8～11棘突及椎板,用单关节骨剪咬去T8～11棘突及T9椎板,充分暴露脊髓,使用脊髓打击器(撞针直径2.5 mm,撞锤质量为15 g,撞锤下落高度20 cm)对T9节段进行撞击,以大鼠出现身体扭曲、后肢回缩扑动及尾部痉挛性摆动为造模成功。造模成功后,采用0.9%氯化钠溶液冲洗伤口,逐层缝合并包扎伤口,消毒后将大鼠置于恒温台等待苏醒。术后单笼饲养,每日2次腹部按摩辅助排尿,直到自主排尿。西药组于建模后0.5 h给予20 mg/kg 醋酸泼尼松注射,之后按照4.9 mg/(kg·d)继续干预;Wnt抑制剂组于建模后0.5 h在损伤部位皮下注射40 μg/(kg·d)IWR-1;烙灸组于建模后24 h在损伤部位局部进行烙灸:将大鼠俯卧置于固定器内,双侧后肢拉直固定,确定损伤大鼠两侧夹脊穴(距损伤上下端两个椎体的棘突间隙旁开距中线3～4 mm 处)后,将特制烙灸器(W形薄铁皮灸槽,长度略超出损伤脊柱长度,带有手柄)盖在该部位,将艾绒放入灸槽内点燃,通过铁器将热传导于患处,使局部发红为宜,避免烫伤,1次/d,每次5 min;Wnt抑制剂+烙灸组于建模后0.5 h在损伤部位皮下注射40 μg/(kg·d)IWR-1,然后按照烙灸组方法进行烙灸。各组均连续干预28 d。

1.4标本采集与处理 干预28 d并完成BBB运动评定量表评定[11]和斜板试验后,处死各组大鼠,每组取5只全身灌注多聚甲醛后,以脊髓损伤为中心取纵向离损伤点长约1 cm脊髓段,制成石蜡包块用于HE染色、免疫组化检测;每组剩余大鼠,以脊髓损伤为中心取长约2 cm脊髓段放入EP管中,液氮速冻,-80 ℃保存,用于Western blot检测。

1.5观察指标及方法

1.5.1后肢运动功能 于脊髓损伤术后第3,7,14,21,28天,由2名不知晓实验分组的观察者采用BBB运动评定量表[11]评定各组大鼠后肢运动功能,评估的指标主要包括各个关节的活动情况、跨步能力、协调性与躯干平衡能力等,评分范围0～21分,0分为无运动功能,21分为正常运动功能,二人背对背进行,取平均值作为每只大鼠运动功能的最终得分。

1.5.2斜板试验 于脊髓损伤术后第7,14,21,28天对各组大鼠进行斜板试验。具体方法:在长方形木板上,将大鼠头部朝前,身体纵轴与倾斜板纵轴垂直放置,逐步增加倾斜板与水平面之间的夹角,以大鼠在斜板上停留5 s不掉落为标准,测定记录倾斜平面临界角度即斜板角度。

1.5.3脊髓组织病理形态 将取出的脊髓组织经脱水和石蜡包埋后切片,厚度为5 μm,脱蜡后用苏木素及伊红染色,于镜下观察脊髓组织病理形态。

1.5.4脊髓组织中Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β蛋白表达情况 分别采用免疫组化法和Western blot法检测。①免疫组化法:将5 μm石蜡切片脱蜡入水,经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水,利用柠檬酸进行微波修复抗原、内源性过氧化物酶阻断、血清封闭后滴加 Nestin(1∶250)、β-catenin(1∶400)、GFAP(1∶400)和GSK-3β(1∶400),4 ℃过夜;PBS漂洗后加入二抗孵育40 min,PBS漂洗后DAB 显色,苏木素复染,盐酸乙醇分化,冲洗返蓝,脱水、透明、中性树胶封固,显微镜下观察并拍片。②Western blot法:取冻存的脊髓组织,加入裂解液(配比按照凯基全蛋白提取试剂盒)研磨10 min,应用BCA 法测总蛋白浓度(凯基BCA试剂盒),SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉室温下封闭1.5 h,加入Nestin(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、GFAP(1∶1 000)和GSK-3β(1∶1 000),4 ℃过夜;TBST洗涤后加入二抗 (1∶20 000)常温反应1 h,曝光。采用Image-lab图像分析系统和Image-Pro图像分析系统计算相对表达量。

1.6统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠BBB运动功能评分和斜板角度 各造模组大鼠 术后各时间点的BBB评分和斜板角度均明显低于同期假手术组(P均<0.05),随术后时间延长,除Wnt抑制剂组的BBB评分和斜板角度无明显变化外,其余各造模组大鼠的BBB评分和斜板角度均呈递增趋势;其中烙灸组和西药组大鼠术后第7,14,21,28天的BBB评分均明显高于同期模型组、Wnt抑制剂组、Wnt抑制剂+烙灸组(P均<0.05),术后第21,28天的斜板角度均明显高于同期模型组、Wnt抑制剂组、Wnt抑制剂+烙灸组(P均<0.05)。见图1。

2.2各组大鼠脊髓组织病理学形态 假手术组大鼠神经元细胞结构完整、形态正常,灰质未见弥漫性水肿。模型组、Wnt抑制剂组、Wnt抑制剂+烙灸组大鼠的脊髓背侧白质和中央灰质均有严重损伤,组织呈海绵状,细胞坏死,可见炎性细胞浸润,内见空洞形成,神经元数量明显减少,胞体结构不完整,颜色浅淡,组织炎性反应较重。烙灸组和西药组大鼠的脊髓结构较清晰,细胞水肿及坏死较轻,空洞面积较小,神经元数量比模型组多,神经元胞体较大,结构相对完整。见图2。

图2 各组大鼠脊髓组织HE染色形态 (A×20;B×100)

2.3各组大鼠脊髓组织中Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β蛋白表达情况 Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β的表达主要出现在大鼠脊髓组织中的中央管周围、前角、后角部位。GFAP和Nestin在假手术组大鼠脊髓组织中有极少量阳性细胞即细胞质染色,GFAP在烙灸组、西药组可见不同程度的棕褐色染色, 与假手术组比较,模型组、Wnt抑制剂组和Wnt抑制剂+烙灸组染色更深。Nestin在烙灸组、西药组、模型组、Wnt抑制剂组和Wnt抑制剂+烙灸组表达染色显著增强,且烙灸组和西药组棕黄色染色较模型组、Wnt抑制剂组和Wnt抑制剂+烙灸组染色更重。β-catenin和GSK-3β在假手术组、西药组和烙灸组中都可见黄色、棕褐色不同程度的染色,且与假手术组比较,模型组、Wnt抑制剂组和Wnt抑制剂+烙灸组染色较浅。模型组、Wnt抑制剂组和Wnt抑制剂+烙灸组脊髓组织中Nestin和GFAP蛋白相对表达量均明显高于假手术组(P均<0.05),β-catenin和GSK-3β蛋白相对表达量均明显低于假手术组(P均<0.05);西药组和烙灸组脊髓组织中Nestin、 β-catenin、GSK-3β蛋白相对表达量均明显高于模型组、Wnt抑制剂组和Wnt抑制剂+烙灸组(P均<0.05),GFAP蛋白相对表达量均明显低于模型组、Wnt抑制剂组和Wnt抑制剂+烙灸组(P均<0.05);Wnt抑制剂+烙灸组β-catenin蛋白表达量明显高于模型组(P<0.05),Nestin、GFAP和GSK-3β蛋白表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3及图4。

图3 各组大鼠脊髓组织中Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β蛋白阳性表达情况(免疫组化染色,×400)

图4 各组大鼠脊髓组织中Nestin、β-catenin、GFAP和GSK-3β蛋白表达情况

3 讨 论

脊髓损伤为最常见的致残性损伤,其病理过程复杂,与机体炎症反应、免疫系统平衡破坏及神经细胞凋亡加快等均有关[12]。中医学认为脊髓损伤是因为外力损伤督脉,致使气乱血逆,瘀阻经络,气血不能温煦濡养肢体所致[13]。烙灸将热、宣、泄、善法集于一体,用刺激性药物或大小、形状不同金属器械烧热后,直接置于经络穴位皮肤上烙灼肌肤,作用于组织经络,起到消炎、镇痛、促进血液循环、增强机体代谢的作用[14];且该疗法具有调节免疫功能、抗氧化应激、抗凋亡作用,能够抑制脊髓损伤局部的炎症反应和脊髓神经细胞的凋亡,改善脊髓损伤后下肢功能[15]。

本实验结果显示,模型组大鼠的后肢运动功能受到影响,脊髓组织出现明显水肿,结构损伤严重并伴有大量空洞形成;烙灸干预后,大鼠后肢运动功能改善,损伤脊髓组织水肿和炎性细胞浸润程度明显减轻,坏死及空洞范围缩小。提示烙灸疗法可促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,可明显减轻脊髓损伤程度。

Nestin是一种中间丝类型的蛋白,由脊髓中央管中的室管膜细胞表达,其为神经发育中神经干细胞的分子标记物之一[16]。GFAP是中枢神经系统中星形胶质细胞活化的生物标志物,存在于白质和灰质的星形胶质骨架中[17],以单体形式存在。Nestin和GFAP参与了脊髓损伤过程,并且都能对创伤性损伤作出反应,当脊髓受到损伤时二者表达水平均显著升高。Wnt信号通路作为一种普遍存在的信号级联,参与多种疾病的生理和病理过程,该通路调控着增殖、自噬、炎症、器官发生和再生等关键过程,在中枢神经系统受损后的神经发育、突触发生及神经元生长、分化和存活中发挥重要作用[9]。GSK-3β和β-catenin是Wnt信号通路中至关重要的信号分子。在典型Wnt/β-catenin信号通路中,机体没有出现Wnt配体,通路中的每一种蛋白都正常表达时,轴蛋白(Axin)会结合β-catenin,Axin同时已结合有GSK3和腺瘤性息肉病结(APC),于是GSK3就可以磷酸化β-catenin,β-catenin接着能够被APC复合物泛素化并降解,此时无法入核启动下游基因转录[18]。夏铂等[5]研究证实,脊髓损伤后进行烙灸可激活Wnt通路,出现Wnt配体时,Wnt受体会结合Axin,β-catenin不会结合Axin,也就不会接触GSK3以及APC,于是入核启动下游基因转录,从而促进神经元增殖分化,通过与损伤轴突形成连接,进一步促使轴突加速生长,达到神经修复目的。本实验结果显示,烙灸组GSK-3β和β-catenin蛋白表达明显增加,GFAP蛋白表达减少,提示烙灸可激活Wnt/β-catenin信号通路,促进损伤脊髓轴突再生,抑制受伤脊髓中的星形胶质细胞瘢痕形成。

综上所述,烙灸疗法可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路,促进脊髓损伤大鼠脊髓轴突再生和神经元存活,从而促进脊髓损伤后的神经修复,为该疗法用于脊髓损伤的治疗提供了一定理论基础。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。