基于GC-MS的3种龙胆属植物的代谢差异分析

武文雅,吴可心,张 迈,穆立蔷

(东北林业大学 林学院,黑龙江 哈尔滨 150040)

龙胆(Gentianascabra)、三花龙胆(Gentianatriflora)、条叶龙胆(Gentianamanshurica)都为龙胆科龙胆属多年生草本植物,龙胆又名粗糙龙胆、龙胆草、山龙胆;条叶龙胆又名东北龙胆[1-2]。3种龙胆均主要分布在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等地,生于草地、湿草地及林下等地[3]。中华人民共和国药典2020版记载以上3种龙胆的根及根茎皆为中药龙胆的可入药材料,中药龙胆味苦、性寒、归肝、胆经[4]。其特征性成分及主要的药用成分为环烯醚萜类化合物、三萜类化合物及口山酮类化合物[5-6]。在现代医学中可治疗急性传染性肝炎、高血压、头晕耳鸣、胆囊炎及由人类病原性真菌引起的疾病等症,是保肝利胆的良药[7-8]。

代谢组学从2000年左右提出概念,到现在,特别是最近几年,保持快速的发展势头。代谢物是中药发挥作用的载体,代谢组学在中医药领域有着非常广阔的应用[9]。药用植物代谢组学是以药用植物为研究对象,采用各种化学分析手段,全局性分析药用植物小分子代谢产物,从整体上定性、定量测定基因或环境对代谢物的影响,从而解析代谢物的代谢合成途径、代谢物网络及调控机制[10-11]。研究内容主要包括药用植物的鉴别和质量评价,药用植物品种选育及抗逆研究,初生、次生代谢途径解析,代谢网络、代谢工程研究及合成生物学研究等几个方面,最终为药用植物品种选育、创新药物研发和质量安全性评价奠定基础[12]。

近年来其药原植物也受到了相应的重视,但大多数都集中在龙胆的研究上,对三花龙胆和条叶龙胆的研究相对较少,这3种龙胆在其成分及成分含量上存在何种差异,本研究将采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术并运用代谢组学的分析方法对其挥发性成分进行定性和定量分析。龙胆属植物以往都是根部被广泛研究利用,但也有研究发现龙胆属植物的叶片中也含有可被开发利用的化学成分[13],所以在本研究中把3种龙胆的叶片也作为研究对象,探究其初级代谢产物,并比较3种龙胆叶片初级代谢产物的差异。龙胆作为一种重要的中药材,在临床医学中被广泛应用,了解其不同药原植物的成分差异,对中药龙胆的开发利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

3种植物样本均于2021年9月采自黑龙江省牡丹江市宁安市小北湖保护区,选取生长环境基本一致,生长年限及长势基本相同的龙胆、三花龙胆、条叶龙胆各10株,每个样本分别采集3个生物学重复,将其根部和叶片取下洗净晾干后冻干备用。

1.2 样品制备

样品制备参照刘洋[14]成熟的GC-MS样品前处理方法,使用安捷伦7890气相色谱仪和飞行时间质谱仪进行GC-MS分析。参考李彤彤等[15]与周妮等[16]的分析条件。系统采用DB-5MS毛细管柱,以无分流模式注入1 μL样品。使用氦气作为载气,通过色谱柱的气体流速为1 mL/min。注入、传输线和离子源温度分别为280、280、250 ℃。在电子碰撞模式下,能量为-70 eV。溶剂延迟6.35 min后,以每12.5个/s光谱的速率,在m/z范围为50～500的全扫描模式下获得质谱数据。

1.3 数据分析

将GC-MS下机数据导入excel进行整理,将整理后的数据矩阵导入SIMCA-P(Umet-rics,Umea,瑞典)软件,对所测代谢物进行主成分分析(PCA)并执行多元回归偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。为找到更准确的差异代谢物,选择PLS-DA模型投影中变量对分组贡献得分(VIP值)>1且单因素方差分析结果显著(P<0.05)的阈值来筛选差异代谢物。将筛选出的差异代谢物输入到KEGG数据库(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html),对代谢途径进行富集和筛选。GC-MS代谢组学数据均使用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0软件进行统计分析(采用单因素方差分析法),使用SIMCA-P软件和微生信在线绘图。

2 结果与分析

2.1 PCA分析

2.1.1 龙胆、三花龙胆、条叶龙胆根部主成分分析 主成分分析(PCA)是一种无监督模式的分析方法,是在不对样品进行预先分组情况下进行的数据分析。3种龙胆根部代谢物的PCA得分情况如图1A所示,主成分累积贡献率为74%。对代谢物采取降维的方法通过少数几个主成分来考察多个样本之间的关联性,图1A显示3种龙胆根部代谢物在坐标轴上是区分开的,表明3种龙胆根部代谢物存在差异。PCA载荷图(图1B)显示将3种龙胆区分开来的代谢物包括塔罗糖、蔗糖、丁二酸、肌醇、D-果糖、柠檬酸、无水草酸、缬氨酸、景天庚酮糖、乳酸及D-甘露糖等。

图1 A:龙胆、三花龙胆、条叶龙胆根部PCA得分;B:龙胆、三花龙胆、条叶龙胆根部PCA载荷

2.1.2 龙胆、三花龙胆、条叶龙胆叶片主成分分析 龙胆、三花龙胆和条叶龙胆叶片代谢物的PCA得分情况如图2A所示,主成分累积贡献率为55.5%,表明3种龙胆叶片代谢物也存在明显的差异。PCA载荷图(图2B)显示将3种龙胆区分开来的代谢物包括3α-甘露二糖、咖啡酸、柠檬酸、葡萄糖、甘氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸及塔罗糖等。

图2 A:龙胆、三花龙胆、条叶龙胆叶片PCA得分;B:龙胆、三花龙胆、条叶龙胆叶片PCA载荷

2.2 PLS-DA分析

由于PCA分析是一种无监督的分析方法,不对样本进行分组,其不能忽略组内误差并消除与研究目的无关的随机误差。所以对样本进行了有监督模式识别的偏最小二乘法(PLS-DA)分析,以达到反应组内及组间差异的目的。

龙胆、三花龙胆和条叶龙胆根部及叶片代谢物的PLS-DA得分如图3(A:根部;B:叶片)所示,结果表明,各组分间聚类良好,且3组样本的根部及叶片在坐标轴上都有明显的区分,说明3种龙胆代谢物在根部和叶片中均存在差异。对PLS-DA模型进行置换检验,根据打乱后建模的R2数据均大于Q2,说明PLS-DA模型的拟合结果稳定、可靠。基于PLS-DA分析结果,得到龙胆、三花龙胆及条叶龙胆根部和叶片的差异代谢物,筛选时参考VIP值与单因素方差分析P2个参数,通过单维与多维结合的方法来从不同角度观察数据,避免只用1种统计分析方法带来假阳性错误及模型过于拟合。为更准确地找到3种龙胆根部及叶片的差异代谢物,最终筛选其中VIP>1且P<0.05的代谢物。根部筛选结果如表1所示,共筛选出58个差异化合物,包括14种糖,25种酸,8种醇及其他11种化合物;叶片筛选结果如表2所示,共筛选出46个差异化合物,包括9种糖,22种酸,5种醇及其他10种化合物。

表1 龙胆、三花龙胆、条叶龙胆根部差异代谢物筛选结果

表2 龙胆、三花龙胆、条叶龙胆叶片差异代谢物筛选结果

图3 A:龙胆、三花龙胆、条叶龙胆根部PLS-DA得分;B:龙胆、三花龙胆、条叶龙胆叶片PLS-DA得分

2.3 差异代谢物分析

2.3.1 差异代谢物概况 3种龙胆根部及叶片的各类差异代谢物占比如图4所示(A:根部;B:叶片),根部差异代谢物中糖类化合物占24.14%,氨基酸类占13.79%,有机酸占29.31%,醇类占13.79%,其他类型化合物占18.97%;叶片差异代谢物中糖类化合物占19.57%,氨基酸类和有机酸类各占23.91%,醇类占10.87%,其他类型化合物占21.74%。根部与叶片中存在相同的差异代谢物,对根部与叶片筛选出的差异化合物进行比对,绘制韦恩图,结果见图4C。其中根部特有差异代谢物为37个,叶片为25个,共有差异代谢物21个,包含β-龙胆二糖、丝氨酸、柠檬酸、D-果糖、D-木糖、L-丙氨酸、L-谷氨酸和L-脯氨酸等化合物。

图4 A:根部差异代谢物分类饼状图;B:叶片差异代谢物分类饼状图;C:根部与叶片差异代谢物维恩图

2.3.2 差异代谢物相对含量的聚类分析 为了更直观地观察差异代谢物在3种龙胆间的含量差异,对筛选出的差异化合物进行聚类分析,聚类是将数据分到不同的类或者簇这样的一个过程,所以同一个簇中的对象有很大的相似性,而不同簇间的对象有很大的相异性。通过聚类分析不仅可以观察各差异代谢物在不同样本中含量的高低,还可通过聚类观察各样本间的差异性。

龙胆、三花龙胆及条叶龙胆根部与叶片差异代谢物聚类热图如图5(a:根部;b:叶片)所示,图中横坐标代表不同的试验样本分组,纵坐标为3组样本筛选出的差异代谢物,可以看出3种龙胆根部及叶片分别聚集在一个大的集群中,表明3种龙胆在所含成分上有一定的相似性;但图中颜色差异表明代谢物的表达量在3种龙胆根部及叶片中均有显著性差异。如图5a显示,在3种龙胆根部筛选出的58种差异代谢物中大部分化合物在龙胆中表达量较高,表现为上调。包括β-龙胆二糖、2-α-甘露二糖、D-木糖、麦芽糖等7种糖;L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-正缬氨酸等8种氨基酸;柠檬酸、苹果酸、无水草酸、硬脂酸、棕榈酸等10种有机酸;核糖醇和木糖醇等5种醇及5种其他类型化合物;上调化合物数量共计35种。如图5b显示,在3种龙胆叶片中筛选出的46种差异代谢物表达量各有高低,其中在龙胆中表现为上调的化合物包括D-木糖、景天庚酮糖等4种糖;丝氨酸、L-脯氨酸、L-正缬氨酸等6种氨基酸;咖啡酸、乳酸、无水草酸等5种有机酸及4种其他类型化合物;上调化合物数量共计19种。

A:条叶龙胆;B:三花龙胆;C:龙胆;红色代表代谢物表达量较高,为上调;蓝色代表代谢物表达量较低,为下调。

2.3.3 差异代谢物通路富集分析 将根部及叶片中的差异代谢物分别在KEGG数据库中找到对应的KEGG ID,在KEGG pathway选项下根部共找到77条代谢通路;叶片中共找到63条代谢通路,为了找到更具价值的通路,只取P≤0.05的通路,绘制差异代谢物KEGG富集通路影响因子图,结果如图6所示(A:根部;B:叶片)。由图6A知3种龙胆根部富集显著且富集到差异代谢物较多的通路有ABC转运蛋白、半乳糖代谢、磷酸转移酶系统(PTS)、淀粉和蔗糖代谢、由鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生的生物碱生物合成、氨基酰基tRNA生物合成等。其中ABC转运蛋白通路富集最为显著且所含的差异代谢物最多,包括D-果糖、D-木糖、葡萄糖、蔗糖、L-谷氨酸、L-丙氨酸、丝氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、麦芽糖、尿素及腐胺。由图6B知3种龙胆叶片富集显著且富集到差异代谢物较多的通路有ABC转运蛋白、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸的代谢、氨基酰基tRNA生物合成、磷酸转移酶系统(PTS)、半乳糖代谢、由鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生的生物碱生物合成等。其中富集最显著的通路为氨基酰基tRNA生物合成,包含的化合物有L-谷氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸;ABC转运蛋白通路中所含的差异代谢物最多,包括D-果糖、D-葡萄糖、纤维素双糖、L-谷氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-脯氨酸、D-木糖、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸及磷酸。

气泡颜色代表富集显著性,颜色越红,富集越显著;气泡大小代表代谢通路中富集到代谢物的多少,越大代表富集到的代谢物越多。

3 结论与讨论

3.1 结论

本研究基于GC-MS的代谢组学技术对中药龙胆的3种不同入药植物进行了代谢组学分析。在龙胆、三花龙胆和条叶龙胆根部检测到58种差异代谢物;龙胆、三花龙胆和条叶龙胆叶片中检测到46种差异代谢物;根部及叶片中一共检测到83种差异代谢物,其中共有的差异代谢物为21种。发现龙胆根部中大部分糖类、氨基酸和有机酸的积累比例均高于三花龙胆和条叶龙胆根部,龙胆根部拥有更多抗氧化性物质和缓解逆境胁迫的调节物质,可以更快地缓解和消除如外界病菌、病虫害、干旱及重金属等逆境胁迫所带来的伤害和影响,更好地保护植物组织和细胞,龙胆在不利条件下具有更强的调节能力及适应性,并且可药用的成分含量也明显高于其他2种龙胆;叶片中的差异代谢物的积累比例在3种龙胆中各有高低。值得一提的是在龙胆根部及叶片中积累比例较高的多种代谢物参与了ABC转运蛋白代谢途径,这条途径基本参与了植物生长发育各个阶段的组织运输,参与其中的代谢物对植物体的生长发育及药用成分累积具有重要作用。本研究从挥发性成分的角度比较了龙胆、三花龙胆及条叶龙胆的药用部位根部及其未被开发利用的叶片部位的化学成分差异,发现龙胆根部的成分及成分含量在一定程度上确实优于三花龙胆及条叶龙胆根部;叶片中也含有许多可被开发利用的可药用成分,为进一步研究中药材龙胆及龙胆、三花龙胆和条叶龙胆种质资源充分利用提供理论支持。

3.2 讨论

ABC转运蛋白是目前已知的最大也是功能最多的转运蛋白家族之一,有研究表明ABC转运蛋白家族基本参与了植物生长发育各个阶段的组织运输,包括植物体应对外界胁迫、植物激素运输和次生代谢物运输等[17-18]。除此之外,其家族成员的转运底物非常丰富,不但包括糖类、脂质和次生代谢物,还包括生物碱、无机离子及类固醇等物质[19-20]。3种龙胆根部及叶片中都含有这条通路,共有19种差异代谢物参与其中,分别为D-果糖、D-木糖、葡萄糖、D-葡萄糖、纤维素双糖、蔗糖、麦芽糖、L-谷氨酸、L-丙氨酸、丝氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、磷酸、尿素及腐胺。L-谷氨酸有刺激植物生长,提高植物对不利气候条件抵抗能力的作用[21-22];L-丙氨酸能够促进成叶绿素的合成,调节气孔开放,对病菌有抵御作用[23];丝氨酸在植物体中可参与细胞组织分化,促进发芽[24];L-脯氨酸可增加植物对渗透胁迫的耐受性,提高植物的抗逆性;L-苏氨酸可提高植物耐受性并增强植物抵御病虫危害的能力[25];甘氨酸对植物的光合作用有独特的效果,利于植物生长,增加作物含糖量,是天然的金属螯合剂[25];L-天冬氨酸作为聚天冬氨酸合成原料可以间接地促进植物生长,优化根系形态,提高根系吸收面积和根系活力,促进植物对养分的吸收[26];L-缬氨酸能够提高种子发芽率,改善植物风味[27];L-异亮氨酸是帮助植物抵抗盐胁迫,提高花粉活力及合成芳香物质的前体物质[28]。L-谷氨酸、L-丙氨酸、丝氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸均可直接作为医药用品或作为合成医药品的中间体。D-果糖、D-木糖、葡萄糖、D-葡萄糖、纤维素双糖、蔗糖及麦芽糖可为植物的生长发育提供能量且可作为植物体物质代谢的碳骨架[29]。以上19种差异代谢物中大部分物质的表达量在龙胆根部及叶片中均表现为上调。表明龙胆在不利的生存环境下自身的调节机制均优于其他两种龙胆,因此植物体内积累下来的化学成分含量相对高于其他两种龙胆,并且所含的可作医药用途的氨基酸类物质含量也高于三花龙胆和条叶龙胆。

在3种龙胆根部差异代谢物中发现的谷胱甘肽代谢途径中,有3种差异代谢物参与其中,分别为L-谷氨酸、尸胺和腐胺。除尸胺外其他2种代谢物的表达量在龙胆中都呈上调。L-谷氨酸作为生物体内最重要的氨基酸之一有着刺激植物生长,提高植物对不利气候条件抵抗能力的作用,杨佳丽[30]研究发现L-谷氨酸可以通过诱导植物自身的抗性来抵御或延缓其病害的发展,L-谷氨酸作为γ-氨基丁酸(GABA)前体物质,激活了植物体内GABA支路上与GABA合成和代谢相关关键基因的表达,GABA支路的激活一方面可能与三羧酸(TCA)循环路径的加强为防御反应提供更多的能量有关;另一方面可能是阻止了活性氧的积累减少了细胞死亡从而不利于腐生型病原菌的侵染。因此,L-谷氨酸对植物抗性的诱导机制可能与GABA支路密切相关。Pia等[31]研究发现L-谷氨酸对多种植物根系的生长具有调节作用。腐胺作为一种多胺在植物体内有调节和缓解胁迫对植株生长抑制的作用。王琳[32]研究发现外源喷施腐胺在干旱胁迫的条件下可缓解植株形态指标及抗氧化酶的活性指标。由于L-谷氨酸和腐胺在龙胆根部的表达量均高于其他2种龙胆,且2种物质均有调节与缓解外界不利条件对植株生长的影响,可以推断龙胆根部可利用成分大部分优于三花龙胆与条叶龙胆可能是由于L-谷氨酸和腐胺在龙胆根部表达量高,在生长过程中较其他2种龙胆有着更强的抵御外界不利条件的能力,从而发育得更为良好,积累下来的可药用成分均高于三花龙胆和条叶龙胆。