基于网络药理学及分子对接探讨湿润烧伤膏促进糖尿病溃疡愈合的作用机制

杨雅量，葛星月，李文武，竺仕林，姚明哲，唐乾利

（右江民族医学院研究生院，广西 百色 533000）

随着社会发展和生活水平的提高，糖尿病已成为全球十大死亡原因之一，而糖尿病溃疡是糖尿病最严重的慢性并发症之一，大约四分之一的糖尿病患 者 会 发 生 难 愈 合 的 糖 尿 病 溃 疡［1，2］，2022 年研究报道，全球糖尿病溃疡患者5 年生存率仅为50.9%，10 年生存率仅为23.1%［3］，目前国际上的治疗措施主要是在控制血糖基础上通过伤口换药、清创治疗、伤口敷料、高压氧等方法但疗效不佳，许多糖尿病溃疡患者最终被迫截肢治疗［4］，可见糖尿病溃疡仍然是治疗费用昂贵、周期长、高截肢风险的临床棘手问题［5］，因此，迫切需要有效的治疗药物来恢复溃疡正常愈合过程。

近年来，诸多研究发现应用湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡、烧伤等难愈性创面时，能显著缩短创面愈合的时间、改善创面形态学的改变，减少瘢痕的形成，进而提高患者的生活质量［6-8］，但其作用机制仍不明确。网络药理学是一门新兴学科，通过“疾病-基因-蛋白质-药物”的相互作用，可以系统、全面地观察药物对疾病的作用，从而揭示中医药与疾病之间的复杂关系［9］。这种研究方法具有整体性和系统性的特点，与中医的整体理论相一致，是目前中药复方药理作用机制研究的主要方法之一［10］。分子对接是一种基于受体与药物分子间相互作用的药物研究方法，可以预测分子相互作用的结合模式和亲和力大小，已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术［11］。本研究联合利用网络药理学和分子对接技术，探索湿润烧伤膏促进糖尿病溃疡愈合的作用机制，以期为湿润烧伤膏的开发与利用提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 数据库与软件

本研究所应用的数据库、软件具体信息见表1。

表1 数据库与软件Tab 1 Database and Software

1.2 湿润烧伤膏活性成分及作用靶点获取及筛选

湿润烧伤膏由黄连、罂粟壳、黄芩、黄柏、地龙等五种药材组成，在TCMSP 数据库中检索黄连、罂粟壳、黄芩、黄柏的活性成分及作用靶点信息，以药代动力学参数（ADME）［12］为依据筛选，由于湿润烧伤膏为外用药物，参照同类研究文献［13，14］，不将口服利用度（OB）列为筛选条件，依据类药性（DL）≥0.18 进行筛选；数据库中无地龙成分和靶点记录，通过查阅与地龙研究相关的文献［15-19］汇总地龙活性成分和靶点信息，最后使用UniProt 数据库将查询所得靶点名称标准化成geneSymbol。

1.3 糖尿病溃疡靶点获取

运用DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb五大疾病数据库，以“diabetic ulcer”为关键词搜索疾病靶点，经合并去重后得到糖尿病溃疡疾病相关靶点。

1.4 湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡靶点的筛选

将1.2 中筛选得到的药物活性成分靶点与1.3中筛选得到的疾病靶点输入生物信息学和进化基因组学分析平台进行匹配映射，并绘制韦恩图，取其交集，获得湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡潜在靶点。

1.5 构建湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡靶点PPI网络

将湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡相关靶点输入STRING 11.5 数据库，构建治疗靶点蛋白-蛋白相互作用网络（protein-protein interaction，PPI），设置蛋白种类为人类，最低相互作用阈值为中等，其他参数保持默认设置，将结果保存为TSV 格式，应用R语言软件绘制靶点互作频次柱状图。

1.6 构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络

运用Cytoscape 3.8.2 软件构建“湿润烧伤膏-靶点-糖尿病溃疡”的关系网络，利用cyto-NCA 插件对网络做拓扑学结构分析，并根据拓扑学参数筛选核心成分以及靶点。

1.7 GO 功能分析和 KEGG 通路富集分析

应用R 语言软件对所获湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡靶点进行GO 和KEGG 富集分析，结果以柱状图和气泡图输出。

1.8 关键化合物和核心蛋白分子对接

从PubChem 数据库将PPI 网络中排名前4 的活性成分的3D 结构下载下来，在RCSB PDB 数据库中找到靶点蛋白的PDBID，保存为pdb 格式，使用PyMOL 软件对pdb 文件进行去除水和原配体处理，Autodock Tolls 软件为靶蛋白分子去水、加氢、分离配体与受体等操作，最后应用Autodock vina 进行对接，通过结合能大小评价对接活性，并通过PyMOL可视化对接结果。

2 结果

2.1 湿润烧伤膏活性成分、靶点获取及筛选

通过TCMSP 数据库及所设定的条件筛选共获得湿润烧伤膏活性成分195 个，其中黄柏70 个，黄连31 个，黄芩72 个，罂粟壳18 个，地龙4 个；再将活性成分输入UniProt 数据库标准化名称，删除重复项和UniProt 数据库找不到名称的活性成分，最终获得37 个潜在活性成分，选取12 个潜在活性成分展示见表2。再提取“RelatedTargets”模块获得100个湿润烧伤膏活性成分对应的靶点。

表2 湿润烧伤膏潜在活性成分基本信息Tab 2 Information of potential active ingredients of moist exposed burn ointment

2.2 糖尿病溃疡靶点筛选

通 过 DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGkb 五大数据库检索关键词“diabetic ulcer”，分别获得12、5 383、163、20、8 个疾病靶点，共5 586个疾病靶点，去重后剩余5 527 个疾病靶点。

2.3 湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡靶点筛选

将100 个湿润烧伤膏靶点与5 527 个糖尿病溃疡的靶点输入生物信息学和进化基因组学分析平台进行匹配映射，并绘制韦恩图，见图1，两者取其交集，获得湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡潜在靶点77 个。

图1 药物与糖尿病溃疡交集靶点Venn 图Fig 1 Venn diagram of drug-DU intersected targets

2.4 湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡靶点PPI网络构建

应用STRING 11.5 数据库构建治疗靶点PPI网络，共形成节点77 个，边数424 条，见图2。应用R 语言软件绘制靶点互作频次柱状图，见图3，将STRING 数据导入Cytoscape3.8.2 软件对网络进行可视化分析，借助cytoNCA 插件进行拓扑属性分析获得核心富集靶点：主要涉及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF）、TP53 基 因（tumor protein p53， TP53）、髓细胞增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene， MYC）、热休克蛋白（heat shock protein， HSP）90AA1，表明这些靶点可能是湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡的关键靶点，见图4（节点颜色深度、节点大小与度值大小成正比）。

图2 湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡靶点PPI 网络Fig 2 PPI network of potential targets of MEBO in treatment of DU

图3 湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡靶点互作频次图Fig 3 MEBO in the treatment of DU target interaction frequency diagram

图4 湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡的关键靶点网络Fig 4 MEBO in the treatment of DU target interaction frequency diagram

2.5 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络构建及分析

在Cytoscape3.8.2 软件中输入湿润烧伤膏活性成分名称和湿润烧伤膏潜在治疗糖尿病溃疡靶点名称，绘制“药物-活性成分-靶点-疾病”互作网络图，见图5；结果显示，湿润烧伤膏中的刺槐素（acacetin、MOL001689）、汉黄芩素（wogonin、MOL000173）、槲皮素（quercetin、MOL000098），吴茱萸次碱（rutaecarpine、MOL002662）这几种活性成分可能在糖尿病溃疡的治疗上发挥主要作用。

2.6 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析

应用R 语言软件对治疗靶点进行GO 和KEGG富集分析。其中生物过程（biological process， BP）339 条、分子功能（molecular function， MF）54 条及细胞成分（cell component， CC）73 条，BP 主要包括离子转运、管径调节、循环系统中的血管生成等生物学过程；MF 主要包括G 蛋白偶联受体结合、细胞因子受体结合、泛素样蛋白连接酶结合等功能；CC主要包括细胞周期蛋白、蛋白激酶复合物、突触后膜内在成分等，选取排名前24 位作柱状图（图6）；KEGG 分析发现主要富集于丙型肝炎、动脉粥样硬化、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase， PI3K）-蛋 白 激 酶B（protein kinase B， PKB/Akt）、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products， AGEs）-晚期糖基化终末产物受体（receptor of Advanced Glycation Endproducts， RAGE）等信号通路中，选取排名前30 位作气泡图（图7），综上显示湿润烧伤膏可能通过调控多个生物学过程、多条信号通路促进糖尿病溃疡愈合。

图7 湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡交集靶点KEGG 富集通路气泡图Fig 7 KEGG enrichment bubble diagram of intersection target of MEBO in the treatment of DU

2.7 分子对接结果

通过RCSB PDB 数据库搜索核心靶点并下载其3D 结构；通过Pubchem 数据库下载湿润烧伤膏活性成分的3D 结构，具体信息见表3。利用AutoDock Vina 和PyMOL 软件进行分子对接，一般认为最低结合能低于-5.0 kJ/mol 则说明两者结合活性良好［20］。本研究发现4 个活性成分与3 个靶点蛋白对接最低结合能均低于-5.0 kJ/mol，具体得分见图8；并且分子对接示意图（图9）显示：各靶点与各活性成分是通过氢键能分子间作用力相结合，进一步说明活性成分与靶点具有良好的结合能力，吴茱萸次碱与TNF 结合能最低，其可能是湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡最有效的活性成分。

图8 分子对接最低结合能热图Fig 8 Heat map of molecular docking minimum binding energy

图9 部分活性化合物与核心靶蛋白分子对接结果Fig 9 Molecular docking diagram of some active compounds with core target proteins

表3 靶点蛋白与活性成分信息Tab 3 Information of target protein and active ingredient

3 讨论

糖尿病溃疡归属于中医学“消渴”“脱疽”范畴。《灵枢·痈疽》曰：“发于足趾，名脱痈，其状赤黑，死不治；不赤黑，不死。不衰，急斩之，不则死矣［21］。”此病由来已久，目前仍很难找到有效的治疗手段。近年来，中医药在治疗糖尿病溃疡方面体现出经济有效的独特优势，典型代表药物湿润烧伤膏能明显改变糖尿病溃疡的病理炎症反应状态，促进血管新生，加快肉芽组织和上皮细胞的生成，明显缩短愈合时间［22-26］，但其作用机制仍不明确。

本研究通过网络药理学方法分析湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡的作用机制，通过构建“药物-活性成分-靶点”网络模型，分析发现湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡的核心活性成分可能为刺槐素、汉黄芩素、槲皮素、吴茱萸次碱。研究表明刺槐素具有抗炎作用，可通过减少组织中的TNF-α 和IL-1β 的释放，抑制活性氧的产生，减轻组织水肿，加快组织修复［27］。而汉黄芩素可通过IL-6/STAT3、PI3K/Akt通路发挥抗炎作用［28］，亦可通过减少胞内活性氧水平，降低胞内的核转录因子κB 活性，进而减弱巨噬细胞介导的炎症反应［29］。槲皮素可增加白介素10、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）的表达，通过调节巨噬细胞M1/M2 表型极化来抑制炎症反应，从而加速糖尿病溃疡的愈合［30，31］。吴茱萸次碱具有保护血管内皮细胞损伤的作用，在内皮细胞损伤模型中，吴茱萸次碱通过减轻内皮细胞凋亡，同时抑制内皮细胞与单核细胞的黏附，进而改善缝隙连接细胞间通讯，保护血管内皮［32］，促进组织修复。

通过Cytoscape3.8.2 软件中cytoNCA 插件进行拓扑属性分析和R 语言KEGG 富集分析发现，交集基 因 主 要 涉 及 TNF、TP53、HSP90AA1 和PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信号通路，提示湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡可能通过调控这些关键基因及信号通路发挥作用。TNF 是一种促炎因子，刺激单核细胞和内皮细胞分泌IL-1β 和IL-6 等炎症因子，此外TNF 可抑制血管内皮细胞中一氧化氮合酶（NOS）的活性，导致NO 诱导的血管舒张减少，从而导致内皮功能障碍，影响愈合过程［33］，已有研究证实湿润烧伤膏能够通过降低IL-6、TNF-α 等因子表达，从 而 改 善 创 面 炎 症 反 应，促 进 愈 合［34，35］。PI3K-Akt 信号通路可参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能调节，研究证实湿润烧伤膏可通过激活PI3K-Akt 信号通路，调控细胞自噬水平，抑制脂多糖诱导的大鼠皮肤成纤维细胞增殖，从而加快大鼠溃疡创面愈合， 以上既往研究结果与本次网络药理学预测一致，表明TNF 和PI3K-Akt 信号通路是湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡的主要作用靶点［36，37］。目前已知TP53 能抑制糖酵解并参与氧化应激，TP53 基因多态性标志物Pro72Arg 与多种糖尿病并发症发病机制相关［38］，T2DM 患者的血清TP53 水平显着升高［39］，结合本次分析结果推测TP53 可能在糖尿病等代谢性疾病中发挥重要作用。AGE-RAGE 信号通路则是糖尿病溃疡愈合过程的重要通路，在高血糖状态下，组织基质和细胞内蓄积大量晚期糖基化终产物（AGEs），AGE 与其配体RAGE 结合后产生多种细胞因子，导致组织持续的氧化应激和炎症反应，延迟溃疡愈合［40，41］。另有研究发现，在AGE 修饰的牛血清白蛋白存在的情况下，表皮角质形成细胞会失去其增殖和迁移能力［42］，并且在伤口中发现AGE 及其配体RAGE 的表达水平增加及AGE-RAGE 结合会抑制表皮角质细胞增殖［43］，表明AGE-RAGE 信号通路与糖尿病溃疡愈合密切相关，另外分子对接结果也显示：槲皮素、吴茱萸次碱等活性成分与关键靶点TNF、TP53、HSP90AA1 的结合活性良好，表明湿润烧伤膏可能通过调节细胞凋亡和增殖以及介导炎症反应、免疫调节等过程在糖尿病溃疡中发挥治疗作用。

综上所述，湿润烧伤膏促进糖尿病溃疡愈合是通过多成分、多靶点、多通路进行作用的复杂过程，通过网络药理学和分子对接初步阐明了其治疗过程可能涉及TNF、TP53、HSP90AA1 等核心靶点，调控PI3K-Akt、AGE-RAGE 等信号通路发挥促愈合作用，为湿润烧伤膏治疗糖尿病溃疡的进一步研究提供了思路，但其作用机制和疗效还需在体内外实验及临床应用中进一步验证。

作者贡献度说明：

杨雅量：文章的构思、论文的撰写；竺仕林：数据收集；姚明哲：数据整理；葛星月、李文武：论文的可行性分析、修订；唐乾利：文章的质量控制与审查，对文章整体负责。

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