大麻二酚对博来霉素诱导肺纤维化大鼠的药效学研究

孙梦迪，张飞宇，高 鑫，王 宇，陈平平，刘树民

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种进行性且不可逆的肺部疾病［1］。肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）病变是由多种信号通路和细胞因子相互作用而引起的。虽然目前对于肺纤维化的发病机制尚不清楚，但是研究表明氧化应激和过度炎症在其中起到了重要的作用。通过了解其病理生理过程的详细机制，可以为IPF 的临床治疗提供更加完善的方案。目前，已经探索了一些治疗肺纤维化的药物，如吡非尼酮和尼达尼布［2］，但并没有显著提高患者的生存率。肺移植是目前治疗PF 的有效方法，但排斥反应、并发症和高治疗费用限制了其临床应用。因此，急需开发新的高效抗肺纤维化药物。

大麻二酚（cannabidiol， CBD）是大麻植物的非精神活性衍生物，因其抗焦虑、止吐、抗炎和抗癌特性而被重视［3］。CBD 作为一种强大的抗氧化剂，作用于各种受体部位，包括PPARγ［4］，5-HT1［5］，腺苷A2A［6］和瞬时电位（TRP）通道受体［7］，直接或间接引起广泛的抗炎和免疫调节作用［8］。之前的研究表明，CBD 能够减少慢性哮喘动物模型中相关细胞因子的产生［9］。最近，已经明确了CBD 参与调控炎症反应，包括炎症性肺部疾病，并对急性和慢性炎症具有积极作用［10-12］。此外，CBD 耐受性良好，没有明显的副作用，它也可能是肺纤维化治疗的有效候选者。然而，关于CBD 治疗IPF 的药理活性和机制的研究很少。因此，本研究旨在探讨CBD 对博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化的作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

取SPF 级SD 雄性 大 鼠60 只，体 质量（190±20） g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，批号：SCXK（黑）2018-003，适应性饲养7 d 后，活动、粪便均未见明显异常方可进入实验阶段。本实验所有相关操作均遵守SPF 级实验室规定及要求，并在黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会批准下进行。

1.2 药物及主要试剂

CBD 购自西安绿如泉生物科技有限公司（批号：LRQ221103-1）； TNF-α（ml002859）、IL-1β（ml037361）、IL-6（ml064292）的ELISA 检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；博来霉素（批号：Z8020）购自索莱宝生物科技有限公司，醋酸泼尼松片（批号：LA22255）购自浙江仙琚制药股份有限公司。

1.3 主要仪器

M200pro 型酶标仪（瑞 士Tecan 公司）；Myi QTM Optics Module 单色Realtime PCR 检测系统（美国Bio-Rad 公司）；Nikon Eclipse Ci-L 型正置白光拍照显微（日本）；KQ250DE 型超声振荡器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.4 动物模型的建立与分组

将60 只大鼠随机分为：正常对照组、模型组、泼尼松组（3.15 mg/kg）、CBD 低中高剂量组（12、36、108 mg/kg）［13］，每周监测大鼠体质重和饮食量。采用气管内注射博来霉素构建肺纤维化大鼠模型。腹腔注射3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，剪开颈部皮肤，暴露气管，使用1 mL 注射器轻轻插入大鼠气管，并在注射器管外口放置棉絮检查其是否插入成功，快速注射博来霉素（5 mg/kg）并继续推注0.2 mL 空气，以确保药液均匀到达肺部，将大鼠皮肤缝合。造模后第2 天开始，每日1 次灌胃给药，共持续28 d。采集样本，取肺组织，称重后保存在4%的多聚甲醛溶液中或在液氮中快速冷冻，然后保存在-80 ℃。

1.5 肺脏器系数和肺组织湿/干质量（W/D）比值的测定

解剖大鼠，取出完整肺组织并吸干表面血液，称量肺质量，计算各组大鼠肺系数：脏器系数=脏器质量/体质量×100%。另称量大鼠右肺上叶的湿质量，并将其放入60 ℃烘箱中烘烤72 h 并称量其干质量，通过计算湿/干质量比值（wet/dry weight ratio）来评估肺的水分含量。

1.6 组织病理学观察

肺组织切片用苏木精和伊红（HE）、马松（Masson）染色，使用正置白光拍照显微获取组织学图像，并评估肺组织炎症和纤维化的组织学征象。

1.7 ELISA 法检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 和肺组织中SOD、MDA、HYP 水平

用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 和大鼠肺组织中SOD、MDA、HYP 含量。

1.8 免疫组化法检测TGF-β1、α-SMA 的含量

将4 μm 厚肺组织切片脱蜡后，0.3%过氧化氢室温孵育10 min，然后在0.01 mol/L 的PBS 中洗涤5 min，再用5%BSA 于37 ℃封闭30 min 后，分别滴加一抗TGF-β1（1∶200）、α-SMA（1∶200）4 ℃过夜，最后用HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体（1∶500）孵育30 min，二氨基联苯胺显色后封片镜下观察。

1.9 qRT-PCR 荧光标记法检测TGF-β1、α-SMA、Nrf2 和NF-κB p65 mRNA 的表达

Trizol 法 提 取 总mRNA 后， 逆 转 录 成cDNA。对各大鼠肺组织内TGF-β1、α-SMA、Nrf2 和NF-κB p65 mRNA 进行PCR 扩增反应，记录Ct 值。引物由北京宝日生物技术有限公司合成提供，见表1。

表1 引物名称及相关序列Tab 1 Primer name and related sequence

1.10 统计学处理

所有统计计算均使用GraphPahPadPrism8 进行。多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态观察

观察各组大鼠发现，正常对照组大鼠精神状态良好，活跃且毛色有光泽，饮水、进食及二便均正常，体质量持续正常增长。模型组大鼠精神萎靡，毛发无光泽，呼吸急促，摄食、饮水量、体重均呈下降趋势。经泼尼松和CBD 给药干预后，大鼠一般状况均有所改善，比较各组体质量发现，泼尼松组和CBD 低、中、高剂量组的大鼠体质量在7、14、21 和28 d 的结果中，均显著高于模型组（P＜0.05）。结果见图1。

图1 CBD 对肺纤维化模型大鼠体质量的影响Fig 1 Effect of CBD on body weight of rats with pulmonary fibrosis

2.2 各组大鼠肺脏器系数及肺组织W/D 比较

模型组肺脏器系数和W/D 都显著高于正常对照组（P＜0.01）。CBD 中、高剂量组肺脏器系数和W/D 值与模型组相比均明显降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。见表2。

表2 大鼠脏器系数及W/D（n=6，±s）Tab 2 Rat organ coefficient and W/D（n=6，±s）

表2 大鼠脏器系数及W/D（n=6，±s）Tab 2 Rat organ coefficient and W/D（n=6，±s）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别肺脏器系数W/D正常对照组模型组0.004 55±0.000 40 0.011 58±0.003 35##3.584±0.113 20 5.656±0.080 65##泼尼松组0.007 10±0.001 64*4.412±0.172 30**CBD 低剂量组0.009 37±0.001 77 CBD 中剂量组5.591±0.115 60 4.395±0.076 88**CBD 高剂量组0.008 31±0.001 65 0.007 66±0.001 72*3.845±0.097 72**F P 8.669 58.2＜0.001＜0.001

2.3 各组大鼠肺组织病理形态学比较

采用HE 染色和Masson 染色分析肺损伤和纤维化程度。与正常对照组相比， BLM 造模28 d 后，大鼠肺组织出现肺泡结构紊乱、肺泡壁异常增厚、基质大量沉积、蓝色胶原纤维数量和成纤维细胞增加。显然，CBD 和泼尼松治疗组在第28 天显著降低了BLM 诱导的肺损伤和纤维化，CBD 组与泼尼松组无显著性差异。此外，肺纤维和肺泡炎评分均显示CBD 治疗组的肺纤维化和肺泡炎症程度均较模型组显著降低（P＜0.05），高剂量组好转度高于低、中剂量组，表明CBD 可改善肺纤维化大鼠的肺纤维化和肺泡炎症程度。结果见图2～4。

图2 大鼠肺组织病理形态学比较（HE，×200）Fig 2 Comparison of pathological morphology of rat lung tissue （HE，×200）

图3 大鼠肺组织病理形态学比较（masson，×200）Fig 3 Comparison of pathological morphology of rat lung tissue （masson，×200）

图4 大鼠肺组织纤维化及肺泡炎评分Fig 4 Rat lung tissue fibrosis and alveolitis score

2.4 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 及肺组织SOD、MDA、HYP 含量比较

与正常对照组相比，模型组大鼠血清中TNFα、IL-6 及IL-1β 含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，各CBD 组大鼠血清中TNF-α、IL-6 及IL-1β 的含量均有所减少，差异有统计学意义（P＜0.05），其中高剂量组大鼠血清中TNF-α 及IL-1β 减少量明显多于低、中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）。此外，与正常对照组相比，模型组肺组织中MDA 和HYP 含量显著升高，SOD 活性显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，CBD 给药组大鼠肺组织中MDA 和HYP 含量均有所降低（P＜0.05），且CBD 高剂量组（108 mg/kg）和醋酸泼尼松组SOD、MDA 活性显著恢复（P＜0.01）。各组大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 血清含量及肺组织SOD、MDA、HYP 含量详见表3。

表3 大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 及肺组织SOD、MDA、HYP 含量（n=6，±s）Tab 3 TNF-α， IL-6， IL-1β in rat serum and SOD， MDA， HYP content in lung tissue（n=6，±s）

表3 大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 及肺组织SOD、MDA、HYP 含量（n=6，±s）Tab 3 TNF-α， IL-6， IL-1β in rat serum and SOD， MDA， HYP content in lung tissue（n=6，±s）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别HYP(mg/mL)TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-1β(pg/mL)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)正常对照组模型组泼尼松组CBD 低剂量组CBD 中剂量组CBD 高剂量组0.023 28±0.003 953 0.074 98±0.007 945##0.051 08±0.005 191*0.059 97±0.005 372 0.044 31±0.006 288*0.043 09±0.004 024**8.81＜0.001 F P 44.2±2.032 144.7±5.281##73.5±6.512**111.7±6.869*98.9±6.032**83.5±5.023**38.70＜0.001 52.0±3.311 128.5±8.687##79.3±8.633**108.2±7.372 104.5±6.400*89.1± 5.559*14.47＜0.001 11.08±1.481 38.19±3.481##22.42±1.853**27.19±2.975*20.99±1.567**23.11±2.060**14.08＜0.001 81.5±2.553 36.5±2.930##65.3±2.033**50.2±2.220*61.5±2.762**63.5±2.018**38.57＜0.001 2.266±0.115 09 4.473±0.255 07##3.149±0.195 02**4.486±0.116 01 3.616±0.228 05*3.221±0.166 01**20.83＜0.001

2.5 CBD 对PF 大 鼠 肺 组 织TGF-β1 和α-SMA 表达的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织中TGF-β1 和α-SMA 的表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，各CBD 组大鼠肺组织中TGF-β1 和a-SMA 的表达均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中CBD 高剂量组大鼠肺组织中TGF-β1 和a-SMA 减少量明显多于低、中剂量组，显示出与泼尼松组相似的效果，差异有统计学意义（P＜0.01），见图5～7。

图5 肺组织TGF-β1 的表达Fig 5 Expression of TGF-β1 in lung tissue

图6 肺组织α-SMA 的表达Fig 6 Expression of α-SMA in lung tissue

2.6 CBD 对PF 大鼠TGF-β1，α-SMA，Nrf2 和NFκB p65 m RNA 表达的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠肺组织中TGF-β1，α-SMA 和NF-κB p65 mRNA 表 达 明 显 增 加，Nrf2 mRNA 表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，CBD 各组大鼠肺组织中TGF-β1，α-SMA 和NF-κB p65 mRNA 的表达均有所降低，Nrf2 的表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05），其中CBD 高剂量组大鼠肺组织中TGF-β1，α-SMA mRNA 降低量明显多于低、中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图8。

3 讨论

IPF 是由遗传和环境因素或其他肺部疾病引起的进行性肺部疾病［14，15］。肺指数是反映IPF 程度的指标之一。在IPF 形成过程中，模型组大鼠的肺重由于炎症细胞浸润，细胞肿胀，毛细血管充血等多种因素而显著增加。同时，大鼠在建模后处于疾病状态，导致体重减轻。因此，模型组大鼠的肺指数显著升高。IPF 的主要特征是细胞外基质的沉积［16］。胶原纤维是细胞外基质的主要成分，羟脯氨酸（HYP）是胶原纤维的特有成分［17］，所以HYP 的含量可以反映细胞外基质的含量。实验结果表明，单次气管内滴注BLM 导致大鼠肺指数和HYP 含量升高，CBD 干预后大鼠肺组织中的肺指数和HYP含量降低，表明CBD 可能对BLM 诱导的大鼠IPF具有保护作用。

肺组织的组织病理学变化是确定IPF 最直观和最重要的指标。光学显微镜下结果显示，模型组大鼠肺泡结构严重受损，肺泡隔增厚，肺泡隔内胶原纤维大量沉积，这表明我们成功地在大鼠中复制了IPF 模型。CBD 治疗后，大鼠肺泡炎症程度和IPF明显降低，提示CBD 对BLM 诱导的大鼠IPF 具有保护作用。

氧 化 应 激 是IPF 的 重 要 发 病 机 制 之 一［18，19］。Nrf2 是生物体中最重要的抗氧化因子［20］。它与抗氧化反应元素相互作用，可以上调体内各种抗氧化蛋白和Ⅱ.期解毒酶的表达，可以消除体内氧化应激产生的自由基［21］。在正常生理条件下，Nrf2 与细胞质中的Keap1 结合，无活性。当细胞受到亲电物质或活性氧攻击时，Nrf2 与Keap1 解离，Nrf2 在细胞核中被激活并与抗氧化反应元件结合，激活下游抗氧化酶蛋白的表达，起到抗氧化作用［22］。最近的研究表明，胡芦巴种子提取物糖苷［23］，红景天苷［24］，吡非尼酮［25］可以激活Nrf2 途径抑制氧化应激的发生，从而抑制BLM 诱导的IPF 的发展。本研究发现CBD可以通过激活Nrf2 途径增强IPF 大鼠的抗氧化能力，从而减少脂质过氧化引起的肺组织损伤。

NF-κB 是由p50 和p65 亚基组成的二聚体化合物，是一种具有广泛生物活性的多功能核转录因子，可被TNF-α、IL-6、IL-1β 等细胞因子激活，参与机体炎症、免疫反应［26］。当NF-κB 被激活时，它从细胞质转移到细胞核以诱导炎症介质的表达［27］。本实验结果表明，气管内给予BLM 后，模型组大鼠血清中的炎症细胞明显增多。CBD 可以显著降低炎症细胞数量和NF-κB p65 在肺组织中的m RNA表达，表明CBD 可以通过抑制NF-κB 途径来减少炎症因子的分泌。

肺成纤维细胞的活化是IPF 发生的关键步骤。致病因子的持续刺激导致成纤维细胞过度增殖和活化，活化的成纤维细胞变为肌成纤维细胞，从而分泌大量细胞外基质，导致细胞外基质沉积，加速IPF 的 发 展［28，29］。肌 成 纤 维 细胞在PF 的 发 生 中 起关键作用［30］，α-SMA 是肌成纤维细胞的特征性标志物。TGF-β1 是引起IPF 的主要细胞因子，主要通过刺激成纤维细胞活化、诱导细胞外基质生成和抑制基质降解参与PF 的发展。结果表明，CBD 可以抑制模型组大鼠肺组织中TGF-β1 和α-SMA 的表达。

本课题组研究了CBD 对BLM 诱导的肺纤维化的影响，并阐明了其潜在机制。在本实验中可以观察到模型组大鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA 蛋白及mRNA 表达均显著升高，且炎症通路NF-κB 的表达明显上调，Nrf2 表达明显下调，经CBD 干预后大鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA 的mRNA 和蛋白的表达明显受到抑制，同时下调NF-κB 的表达，上调Nrf2表达，并且下游炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的表达与NF-κB 通路一致，尤以高剂量CBD 改善效果最佳，证实CBD 可作用于不同途径以降低肺泡炎症和纤维化程度，为有效的治疗药物。

综 上 所 述，CBD 对BLM 诱 导 的IPF 大 鼠 具 有保护作用，其潜在机制可能与抑制炎症反应，增强抗氧化能力和抑制TGF-β1 和α-SMA 的蛋白表达有关，本研究可为CBD 在治疗肺纤维化中的作用机制提供一些新的见解。

所有作者声明不存在利益冲突关系。