长期不同剂量硒处理对盆栽甜樱桃部分生理参数的影响

田 洁,孙协平,高少兵,凌 敏

(1 长江师范学院现代农业与生物工程学院,重庆涪陵,408100;2 湖南农业大学园艺学院,长沙,410128)

甜樱桃(Cerasusavium),又名大樱桃和欧洲甜樱桃,果粒大、色泽鲜艳、营养丰富,果实成熟期又值晚春和初夏新鲜水果缺乏期,故备受市场青睐[1-2]。近年来,我国重庆、四川、云南及贵州等地甜樱桃产业有一定发展[2-3]。硒是植物有益元素,在提高果树的抗逆性和果实品质上作用明显[4-5]。然而,不同植物对硒的吸收、转运和富集能力存在显著差异[6]。一般低剂量硒能够明显提高作物生理活性促进生长发育,而高剂量降低生理活性抑制生长发育。有关硒对甜樱桃的影响研究,仅限于叶面喷施硒对甜樱桃果实品质、褪黑素和抗氧化方面的研究[7-9],有关硒胁迫对甜樱桃的影响研究较少。对硒具有较高富集能力和耐受性的农作物,可作为人体补充硒元素的重要桥梁。利用不同形态硒和施用方法提高果树生理活性,并生产出富硒水果,这在梨[10]、杧果[11]、火龙果[12]和甜樱桃[8]上均有报道。根施硒时,六价硒(硒酸盐)的利用效率显著高于其他形态硒[7-11]。目前,关于甜樱桃对硒的富集和耐受能力,尚无定论。叶片生理参数除了对硒施用剂量响应外,处理时间的影响也比较明显[13]。本研究以4年生盆栽甜樱桃树为试材,对4种剂量六价硒处理后植株营养和生殖生长参数以及叶片质量、叶片抗氧化物质等生理参数进行比较,以探究甜樱桃对硒的耐受性,进而为富硒甜樱桃生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

以盆栽4年生“俄罗斯8号”甜樱桃为试验材料。于2020年1月25日在重庆市涪陵区义和镇开心农场的设施连栋避雨大棚内,将4年生“俄罗斯8号”甜樱桃(砧木为草樱,干高50～60 cm,地径2.5～3 cm)移植于体积为46 L的塑料花盆内,一株一盆。盆栽基质为未腐熟稻壳、腐熟蚯蚓土以及紫色土园土,三者体积比为1∶4∶5。移栽后进行统一的土肥水病虫害管理至2020年5月3日,随后筛选出长势均匀一致的盆栽植株进行不同施硒处理,花盆底部排水孔用胶封住,根周围插入6根竹棍便于通气。以硒酸钠为硒源,称取硒(以硒元素计)0、32、64、96 mg,溶于2 L水中,均匀浇灌于根周围。每个处理4个生物重复,单株为1个重复。此后进行统一栽培管理。于2021年5月10日在天气晴朗的下午分别采集功能叶,用冰盒保存带回试验室。自来水洗净、擦干后,用直径为1.5 cm的打孔器打出圆叶片,每6个圆叶片为1组,用做好标记的锡箔纸包裹进行液氮速冻后,储存在超低温冰箱里。

1.2 试验方法

取甜樱桃圆叶片,放置于鼓风干燥箱80 ℃烘干后,称质量,通过打孔器的直径计算出圆叶片面积。圆叶片干质量除以圆叶片面积即为比叶重。参考向芬等[14]的方法,将甜樱桃圆叶片放入10 mL离心管中,再加95%乙醇8 mL,浸泡一段时间,至叶片完全褪色,上清液即为叶绿素提取液。取0.1 mL上清液于试管中,加入95%乙醇1.9 mL,摇匀,以95%乙醇为空白对照,测量在665、649、470 nm处的吸光度,计算叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b、叶绿素a/b和类胡萝卜素含量[15]。

采用蒽酮硫酸法[15]测定可溶性糖含量。取圆叶片加入少量石英砂和80%乙醇4 mL,研磨成匀浆,80 ℃水浴锅保温40 min,4 000转/min离心4 min,取上清液,再用80%乙醇定容至10 mL,摇匀,即为可溶性糖提取液。取0.1 mL提取液于试管中,加入2.9 mL蒽酮试剂,摇匀后在90 ℃水浴锅中保温15 min,迅速冷却,以80%乙醇0.1 mL和蒽酮试剂2.9 mL为空白对照,测量在620 nm处的吸光度,计算可溶性糖含量。

参考陈嘉勤[16]方法测定丙二醛含量。取圆叶片加入少量石英砂和10%三氯乙酸2 mL,研磨成匀浆,再加10%三氯乙酸2 mL进一步研磨。分装入两个2 mL离心管中,4 000 r/min离心10 min,合并上清液,即为丙二醛提取液。取17个离心管编号,16个样品管各加1 mL提取液,一个对照管加1 mL蒸馏水,再各加0.6%硫代巴比妥酸溶液1 mL,摇匀,在沸水浴中反应15 min,迅速冷却后离心,取上清液,在450、532、600 nm波长下测定吸光度,计算丙二醛含量。

参考杜明等[17]的方法测定叶片硒含量。取圆叶片置于鼓风干燥箱60 ℃烘干,称取0.5 g,装入离心管中,再用研磨机(60 Hz频率)研磨成粉末状,送样至青岛科创有限公司测量。样品经硝酸消解后,利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定硒元素含量。

采用动态闪烧法(改进杜马法)[18]测定氮元素含量。取圆叶片置于鼓风干燥箱60 ℃烘干,称取0.5 g,装入离心管中,再用研磨机(60 Hz频率)研磨成粉末状,送样至自然资源部第三海洋研究所测量。

目测统计开花株数、开花数、无雌蕊和双雌蕊花总量和着果数,计算开花株率和开花树平均花量等。

采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法[19]检测花粉活力。用毛笔轻蘸少量花粉置于载玻片上,轻轻滴入1%TTC溶液1滴,盖上盖玻片后将载玻片放入恒温箱中培养,温度设置为25 ℃。15 min后置于显微镜下观察,红色花粉为有活力,无色花粉则没有活力。花粉活力=(视野内有活力花粉数/视野内总花粉数)×100%。

1.3 数据分析

使用Origin 8.5软件进行数据分析,采用LSD法进行差异显著性检验,采用皮尔逊相关分析线性相关性。

2 结果与分析

2.1 不同剂量硒处理下叶片硒和氮含量

从表1中可知,在长期处理下,32和64 mg/株硒处理下叶片硒含量高,其次是对照,而96 mg/株硒处理下叶片硒含量最低。32 mg/株硒处理下叶片氮含量最高且与对照差异显著,64和96 mg/株硒处理下叶片氮含量显著下降。比叶重受硒处理剂量影响不显著。

表1 长期不同剂量硒处理对甜樱桃叶片硒氮元素和比叶重的影响

2.2 不同剂量硒处理下叶片色素含量

从表2中可知,长期处理下,不同剂量硒处理下叶片叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b含量差异均不显著;随硒剂量增加,叶绿素a/b和类胡萝卜素含量呈现出先降后升的变化趋势,32 mg/株硒处理显著低于96 mg/株硒处理,但各硒处理与对照差异均不显著。

表2 长期不同剂量硒处理对甜樱桃叶片色素含量的影响

2.3 不同剂量硒处理下叶片可溶性糖和丙二醛含量

从图1可见,在长期处理下,硒剂量32和64 mg/株处理叶片可溶性糖含量与对照差异不显著,但当硒剂量达96 mg/株时显著高于其他处理和对照。叶片丙二醛含量受硒处理剂量影响不显著。

图1 长期不同剂量硒处理对甜樱桃叶片可溶性糖和丙二醛含量的影响

2.4 叶片硒含量与其他生理指标相关性

相关性分析结果表明,在长期处理下,叶片硒含量与叶绿素a+b、叶绿素a/b、可溶性糖含量的皮尔逊相关系数分别为-0.01、0.08、-0.16,即线性相关性极弱;叶片硒含量与叶片氮、比叶重、叶绿素a、叶绿素b、丙二醛含量的皮尔逊相关系数分别为-0.48、0.44、-0.2、0.42和0.33,即呈现低度线性相关;叶片硒含量与类胡萝卜素含量的皮尔逊相关系数为-0.73,显著(p<0.05)负相关。

2.5 不同剂量硒处理下生殖生长指标

从表3可见,随着硒剂量的增加,开花株率呈现上升趋势,在96 mg/株硒处理下100%开花。从开花树平均花量来看,对照最多,其次为96 mg/株硒处理。总花量来看,以96 mg/株硒处理最多,其次为64和32 mg/株硒处理,对照最低。不同剂量硒处理对花粉活力影响不显著,花粉活力均为0%。硒处理中存在无雌蕊和双雌蕊现象,对照无此现象。从花后着果总量来看,硒处理促进了着果。

表3 不同剂量硒处理对甜樱桃生殖生长的影响

3 讨论

在自然高硒条件下,大多数植物属于非富集硒植物,即植物体内硒含量低于100 mg/kg(以干质量计),并且当植物硒含量在3～100 mg/kg(以干质量计)会产生硒胁迫[20-21]。在本研究中,根据盆栽土壤容重和体积初步得出64 mg/株处理的土壤硒含量为 0.4 mg/kg(属于富硒土壤标准),甜樱桃叶片硒浓度最高仅为15.34 mg/kg,大大低于硒聚集植物,如壶瓶碎米荠(Cardaminehupingshanesis)在土壤硒含量10～70 mg/kg(以干质量计)条件下,叶片积累的最大硒含量为1 965 mg/kg(以干质量计)[20]。64 mg/株处理下盆栽甜樱桃叶片硒含量最大(15.34 mg/kg),当甜樱桃长期在96 mg/株处理下叶片硒含量仅为2.87 mg/kg,已存在明显的硒胁迫现象,可见甜樱桃与大多数植物一样属于非富集硒植物。从本试验结果来看,盆栽甜樱桃叶片硒临界水平在15.34 mg/kg附近。在长期处理下,未施硒处理对照叶片硒含量达6.00 mg/kg,这是因为施硒处理的硒以小分子硒化物排散到大气中,进而通过气孔进入未施硒处理对照植物叶片[22]。相比64 mg/株处理,96 mg/株高剂量硒处理盆栽甜樱桃叶片硒含量明显下降,并且还显著低于对照,这可能是因为通过地上部挥发排硒和根系降低吸收或转运量来抵御硒的胁迫。高剂量硒(硒酸钠)也显著降低莳萝(Anethumgraveolens)地上部和地下部的硒含量,地上部硒含量略高于地下部[23],推测主要通过降低硒的吸收来抵御硒的胁迫。对于非富集硒植物而言,硒的有益剂量和毒性剂量之间的界限狭窄[24-25],高硒水平对植物生长生理的危害大[26],不同植物促进生长的硒最佳阈值存在差异,并且与硒形态、植物生育期和环境密切相关[27-30]。

大多研究表明,硒能够提高植物叶片色素含量,仅在硒剂量极高时,叶片色素含量才显著下降[26]。在本研究中,甜樱桃叶片叶绿素含量受硒剂量的影响不显著,叶片硒含量与叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素a+b含量无显著的线性相关。在高硒胁迫下,莳萝叶片色素含量也是高于对照,而与其他浓度硒处理差异较小[23]。植物在逆境胁迫下,一般叶绿素a会转化为叶绿素b,从而导致叶绿素a/b值下降。在本研究中,不同剂量硒处理对叶绿素a/b的影响无线性规律,叶绿素a/b不能作为硒胁迫的指示参数;叶片硒含量与类胡萝卜素含量显著负相关,可见,叶片硒含量能够影响甜樱桃叶片类胡萝卜素合成代谢,内在机制尚需要进一步研究。丙二醛是植物器官衰老或者在逆境胁迫条件下发生膜质过氧化作用产生的过氧化物之一,是胁迫产生的重要参数[16]。在本研究中,各硒剂量处理的叶片丙二醛含量差异未达到显著水平,叶片丙二醛含量也不能作为硒胁迫的指示参数。有研究发现,在硒短期处理下,叶片硒含量、比叶重、类胡萝卜素含量、叶片丙二醛含量、氮含量参数随着硒剂量的增加呈现出规律性变化[31]。本研究发现,在硒长期处理下,叶片可溶性糖含量显著上升,氮含量显著下降,两者可作为硒胁迫的有效参数,尤其是叶片氮含量比其他参数提前发生明显变化。Gouveia等[25]的研究得到了相似结论,即硒处理下碳和氮含量等初级代谢化合物增加可能通过渗透调节来防御硒胁迫,可以作为一种有效的生物标准来指示硒对植物的胁迫。

重庆低海拔地区是甜樱桃种植的非适应区[2],通过一定的技术手段促进花芽分化和开花结果是当前需要解决的主要问题[3]。硒对植物生殖器官的影响鲜有报道。本研究发现,根施六价硒对甜樱桃生殖生长有明显的促进作用,主要体现在甜樱桃开花株率、总花量和着果总量等方面。程丹等[32]的研究也表明,根施外源硒能够明显提高杭白菊单株开花量。说明,硒具有促进植物生殖生长的功能。本研究中,不同剂量硒处理甜樱桃花粉活力皆为零,花后着果量低,呈现出一定的“花而不实”现象,这可能与重庆低海拔属于甜樱桃非适宜区,冬季不能满足需冷量等因素有关。在其他非适宜区,如:上海[1]和杭州[33]等均有类似现象发生。这些地区,可以通过单氰胺处理[33]等技术手段促进甜樱桃生殖生长。

4 结论

在长期硒处理下,甜樱桃叶片硒含量与叶片叶绿素a+b、叶绿素a/b、可溶性糖、氮、比叶重、叶绿素a、叶绿素b、丙二醛含量等生理参数相关性弱,仅与类胡萝卜素含量呈现显著负相关。甜樱桃硒胁迫现象主要表现为叶片可溶性糖含量上升、氮含量下降,叶片可溶性糖含量和氮含量可作为甜樱桃硒胁迫预警主要参数,尤其是氮含量。根施硒酸钠有利于盆栽甜樱桃生殖生长。