夜来香花叶病毒江西分离物的分子特征与序列分析

顾佩佩,王 莹,黄爱军

(赣南师范大学生命科学学院,江西赣州,341000)

夜来香花叶病毒(Telosmamosaicvirus,TeMV)是一种正义单链RNA病毒,为马铃薯Y病毒属成员[1-2]。该病毒最早发现于夜来香Telosmacordata,可在寄主叶片上引起典型的花叶症状[3]。随后发现TeMV也可侵染广藿香Pogostemoncablin[4]、翅荚决明Sennaalata[5]、西番莲(Passiflora)[6]等寄主并引起症状。特别是在西番莲上,可引起严重的花叶、褶皱、畸形等症状,且该病毒可通过扦插、嫁接以及机械接种等途径传播,在田间具有较高发病率[7-8]。研究发现,TeMV在我国广西、福建、海南、广东和贵州等5个西番莲产区的田间检出率均较高,福建和广西的检出率达到80%以上,在贵州不同县(区)甚至高达100%,该病毒已严重影响我国西番莲产业的健康发展[9-10]。近年来,西番莲在江西赣南地区的种植面积不断扩大,种植过程中也不断遭受病毒病为害,TeMV在该地区田间检出率也较高。本研究对前期采集的3个赣南地区TeMV分离物基因组全长进行克隆测序及序列特征分析,以便为后续开展TeMV种群遗传特征分析、病毒变异与进化等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

西番莲病样于2020年采自江西省赣州市寻乌县、瑞金市及于都县西番莲种植园,病样均表现出花叶、皱缩、畸形等典型病毒病症状。通过Potyvirus通用型抗体进行ELISA检测确定样品感染马铃薯Y病毒,再以TeMV特异性检测引物进行RT-PCR扩增[11]、克隆测序,确定病样感染TeMV。感病植物样品经扦插成活后保存于实验室备用。摩擦接种试验所用豌豆、菜豆、黄瓜、番茄、辣椒、红苋菜种子购自河北省泊头市永红种业有限公司,本生烟、苋色藜和紫果西番莲种子为本实验室保存。

1.2 主要试剂

Reagent Set for Potyvirus Group (Poty),96 testwells SRA 27200/0096,购自美国Agdia公司;RNA-easy Isolation Reagent、HiScript II One Step RT-PCR Kit、HiScript-TS 5′/3′ RACE Kit,购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、DH5α感受态,购自宝生物工程(大连)有限公司;0.1 mol/L PBS为实验室自行配制。

1.3 方法

1.3.1 摩擦接种试验和RNA提取 将单独感染TeMV的西番莲叶片和0.1 mol/L PBS按1∶10质量体积比(g/mL)研磨后,使用研磨物体分别摩擦接种豌豆、菜豆、黄瓜、番茄、辣椒、红苋菜、本生烟、苋色藜和西番莲实生苗,将摩擦接种0.1 mol/L PBS作为阴性对照,染病西番莲叶片作为阳性对照;接种9 d后观察叶片症状并采集新叶进行病毒的ELISA和RT-PCR检测。

总RNA提取:参照试剂RNA-easy Isolation Reagent说明书进行总RNA提取,RNA于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 引物设计与合成 根据GenBank中已报道的TeMV分离物(GenBank登录号:MK340754、MK340755和MT557572)全基因组序列,利用软件Oligo7分段设计扩增TeMV江西分离物全长基因组的引物5对。根据测序拼接结果及GenBank中下载的参考序列设计5′、3′端RACE扩增引物,引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所用引物相关信息见表1。

表1 TeMV全基因组扩增所用引物信息

1.3.3 基因组克隆与序列分析 RT-PCR反应参照HiScript II One Step RT-PCR Kit说明书进行。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后,依照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit说明书纯化目的条带,纯化产物与pMD19-T载体进行连接后,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑选经菌液PCR验证的阳性克隆送至苏州金唯智生物科技有限公司测序,5′和3′端依照HiScript-TS 5′/3′RACE Kit说明书进行扩增。

测序结果利用DNAMAN软件拼接后获得分离物全长。TeMV其他分离物序列均下载于NCBI,运用在线工具Pairwise Sequence Alignment(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)进行序列一致度分析,利用MEGA 7.0软件进行序列比对分析,以邻接法(NJ)构建系统发育树,Bootstrap值设置为1 000。

2 结果与分析

2.1 摩擦接种

实验室条件下,TeMV江西分离物可通过摩擦接种侵染本生烟、苋色藜、豌豆、菜豆和西番莲,其中豌豆寄主为本研究首次发现。感染TeMV本生烟新叶表现出轻微黄化、卷叶症状;苋色藜和菜豆接种叶片出现过敏性坏死反应,苋色藜叶片出现由黄点到黄斑的坏死症状,菜豆叶片出现浅褐色小米粒大小的局部坏死斑;西番莲新生叶片表现为花叶、皱缩和畸形;感染TeMV豌豆不表现任何症状(见图1)。3个分离物在接种植物上产生的症状无明显差异。

注:RT-PCR检测中M为2 000 bp DNA marker,+为接种TeMV分离物,-为接种0.1 mol/L PBS,P为TeMV病样,N为接种0.1 mol/L PBS,B为对照(空白)。图1 TeMV江西分离物侵染寄主植物引起的叶片症状及病毒ELISA与RT-PCR检测

2.2 TeMV江西分离物基因组结构特征

所获3个TeMV分离物分别命名为TeMV-XW、TeMV-RJ和TeMV-YD,除poly(A)尾外,序列长度均为10 069 nt,NCBI登录号分别为ON932194、ON932195和ON932196。序列仅含1个编码框,位于基因组190-9815 nt处,编码1个3209 aa的多聚蛋白;经水解酶切后形成成熟蛋白11个,即Pl、HC-Pro、P3、PIPO、6K1、CI、6K2、Vpg、NIa、NIb和CP。通过与其他TeMV分离物的氨基酸序列进行比对,确定多聚蛋白的9个切割位点,即EVHHY/S、HYRVG/G、DVQTQ/G、DVRLQ/S、TVRMQ/S、SVSTQ/G、FVKVE/S、AVKTQ/S和SVSLQ/S(见图2)。

图2 TeMV江西分离物基因组结构及与其他分离物蛋白酶切位点的比较

2.3 TeMV江西分离物序列相似性与系统进化分析

对TeMV分离物进行序列一致性分析发现,TeMV-XW、TeMV-RJ和TeMV-YD间的核苷酸及氨基酸序列一致性范围分别为98.1%～98.6%和98.8%～99.3%;以上与GenBank中已报道的寄主植物为西番莲的TeMV分离物间的核苷酸及氨基酸序列一致性范围分别为87.3%～98.9%和91.2%～99.5%。3个分离物均与武夷山分离物(MK340755)序列一致性最高,与海南分离物(MG944249)序列一致性最低。

以西番莲严重斑驳病毒(Passion fruit severe mottle virus,PFV)为外组,以不同寄主来源的TeMV分离物CP基因组序列构建系统发育树发现,所有分离物共聚为2个大组。3个江西分离物与7个寄主为西番莲的分离物在一组(GroupⅠ),并与武夷山(MK340755)及越南分离物(MT557572)聚为一簇;寄主植物非西番莲的分离物聚成一组(GroupⅡ),其中相同寄主来源的分离物各自聚集,表现出一定的寄主特异性(见图3)。

图3 基于病毒CP基因组序列构建TeMV江西分离物与其他分离物的系统进化树

3 结论与讨论

TeMV是近年来我国西番莲上报道较多的病毒,侵染西番莲后将影响其植株与果实的发育,从而降低其产量与品质[12]。本研究首次获得3条TeMV江西分离物全基因组序列,通过与其他地区不同寄主植物分离物的CP基因进行系统发育分析,结果显示TeMV各分离物在遗传多样性上与寄主来源有一定联系,推测该病毒在侵染不同寄主过程中发生了遗传变异,以适应不同寄主环境。在西番莲内分离物变异较小,推测病毒可能是通过无性繁殖方式传播,应加强种苗监测工作,防止病毒的进一步蔓延。

本研究首次发现TeMV能够侵染豆科作物豌豆,推测其在田间可能存在更多寄主。豆类作物在我国常与其他作物混种,这也为TeMV的传播提供了便利,病毒一旦通过豆类传播至其他作物,可能造成严重的产量损失。因此,后续应加强TeMV在各类田间作物中的发生调查,确定其是否存在更广的寄主范围,从而为该病毒的防治提供科学依据。