基于双样本孟德尔随机化的特应性皮炎与圆锥角膜因果关系研究

魏熙翔 杨晖 尹雪 傅征 熊薇薇

作者单位：厦门市儿童医院 复旦大学附属儿科医院厦门医院眼科，厦门 361000

圆锥角膜（Keratoconus，KC）是一种非炎症性角膜营养不良症，其特征为进行性角膜变薄和扩张，导致视力损失。KC通常呈双侧发病，并主要影响年轻人[1]。尽管其具体原因尚不完全清楚，但遗传、环境因素以及过敏性疾病可能在其发病机制中发挥一定作用[2]。过敏性疾病广泛影响着发达国家多达三分之一的人口，包括皮肤（如特应性皮炎）、呼吸道（如哮喘、变应性鼻炎）和眼睛（如变应性结膜炎），而研究发现很多KC患者也患有特应性皮炎[3-4]。

特应性皮炎是一种慢性炎症性皮肤病，通常与异常免疫系统反应和遗传因素相关。其症状包括皮肤干燥、瘙痒等，常见于婴儿和儿童，但也可能持续至成年期[5-6]。尽管特应性皮炎和KC是2种不同的疾病，但众多研究表明它们之间可能存在某种关联。在一般人群中，KC的患病率约为1/2 000[7]。而对于特应性皮炎患者，K C 的患病率可达0.5%～39%[8]。然而，由于观察研究中存在偏倚和混杂因素，二者的因果效应仍不明确。明确特应性皮炎与KC之间的因果效应能有效提高KC的初级预防策略。作为一种遗传流行病学统计方法，孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）研究利用遗传变异作为工具变量（Instrumental variables，IVs），可以有效减少偏倚和混杂对结果的影响，从而提高因果推断的准确性[9]。

本研究旨在运用MR研究方法，探索特应性皮炎对KC发病风险的因果效应。

1 对象与方法

1.1 对象

本研究中的特应性皮炎和KC的全基因组关联研究（Genome-wide association study，GWAS）数据来源于FinnGen数据库（https://www.finngen.fi/fi）。诊断标准基于个体的自述病史以及国际疾病分类第9 版和第10 版。在进行全基因组关联分析时，已进行年龄、性别和前10 个基因主成分的校正。特应性皮炎患者样本为7 024例，对照组为198 740 例，数据集为“finn-b-L12_ATOPIC”，对照组人群与样本人群具有相似的基线特征（如人种、年龄、生活环境），但无特应性皮炎；KC患者样本为311例，对照组为209 287例，数据集为“finn-b-H7_CORNEALDEFORM”，对照组人群与样本人群具有相似的基线特征（如人种、年龄、生活环境），但无KC。

1.2 统计学方法

1.2.1 工具变量选择 利用R软件从GWAS数据中筛选与特应性皮炎和KC相关的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）作为工具变量。主要筛选条件：①P<5×10-8，如果该条件下的工具变量数目<5个，则条件放宽为P<5×10-6；②移除连锁不平衡（r²=0.001，kb=10 000）[10-11]；③使用F统计量来排除较弱的工具变量，当F<10时，表明该工具变量可能受到较弱工具变量的偏倚影响[10]，因此将其剔除以避免对结果产生影响。

1.2.2 MR方法选择 本研究采用逆方差加权法（Inverse variance weighted，IVW）作为主要分析方法，使用随机效应模型。该方法假设所有遗传变异位点的因果效应估计值相等且无水平异质性，并通过回归分析获得每个位点与表型之间的关联效应估计值和标准误差。此外，还采用加权中位数法和MR Egger法对上述结论进行补充。

1.2.3 敏感性分析 首先，使用IVW法的CochranQ检验评估各个SNP之间的异质性，若P<0.05，表明结果存在异质性。其次，采用孟德尔随机多态性残差和离群值（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR PRESSO）法检测SNP异常值，设置迭代次数为5 000，若P<0.01，表明存在离群值，需将其剔除并重新进行分析。第三，使用MR Egger截距进行水平多效性检验（MR Egger intercept test），若不存在水平多效性，截距应为0，并且P>0.05。第四，采用“留一法”进行检验，通过每次排除单个SNP进行分析，以确定是否存在异常的SNP。第五，构建漏斗图和森林图对MR的水平多效性进行可视化。当P<0.05时，表示MR分析结果存在潜在的因果关系，并具有统计学意义。所有的统计分析均使用R软件4.1.2版本中的“ Two Sample MR”包进行。

2 结果

2.1 特应性皮炎与KC的MR分析

在排除存在连锁不平衡的SNP后，本研究共选取了与特应性皮炎相关的19个SNP作为工具变量，并确保这些工具变量不受弱工具变量的影响（F均>10）。经过将特应性皮炎数据与KC数据进行匹配，最终纳入了19个SNP作为工具变量（表1）。IVW的分析结果显示，特应性皮炎与KC之间存在显著的风险关联[OR=1.46，95%可信区间（Confidence interval，CI）：1.08～1.97，P=0.013]。加权中位数法（OR=1.27，95%CI：0.82～1.96，P=0.275）和MR Egger法（OR=1.13 ，95%CI：0.53～2.40，P=0.753）未能检测到特应性皮炎与KC之间的显著因果关系。敏感性分析表明，特应性皮炎与KC之间的SNP没有显著的异质性（CochranQ检验，Q=16.25，P=0.575）；MR PRESSO的结果显示未检测到异常的SNP（P>0.05）。散点图结果表明，与特应性皮炎和KC密切相关的SNP具有稳定性。尽管加权中位数法和MR Egger法未能检测到特应性皮炎与KC之间的显著因果关系，但2种方法的结果与IVW的方向一致，且OR均>1，结合IVW的分析结果，表明特应性皮炎可增加KC的风险（图1）。漏斗图结果显示SNP呈对称分布，MR分析未显示多效性（图2）。MR Egger截距测试结果显示MR分析未呈现水平多效性（截距值为0.045，P=0.478）。通过“留一法”敏感性分析，未发现单个SNP对整体结果产生较大影响（图3）。

表1.与特应性皮炎有关的SNP信息Table 1.The SNP information associated with atopic dermatitis

图1.特应性皮炎与圆锥角膜因果关系的散点图Figure 1.Scatter plot illustrating the causal relationship between atopic dermatitis and keratoconus SNP, single nucleotide polymorphism; MR, Mendelian randomization.

图2.特应性皮炎对圆锥角膜因果影响的漏斗图Figure 2.Funnel plot depicting the causal impact of atopic dermatitis on keratoconus βIV, the effect size of the allele; 1/SEIV, the standard error of the effect size of the allele; MR, Mendelian randomization.

图3.特应性皮炎对圆锥角膜因果影响的“留一法”敏感性分析结果Figure 3.Sensitivity analysis results of the causal impact of atopic dermatitis on keratoconus using the "leave-one-out" approach The black dots represented the causal effect estimate when excluding the SNP and using the remaining SNPs as instrumental variables; the horizontal black lines represented the 95% confidence intervals of the causal estimate.SNP, single nucleotide polymorphism; MR, Mendelian randomization; AD,atopic dermatitis; KC, keratoconus.

2.2 KC与特应性皮炎的MR分析

在排除存在连锁不平衡的SNP后，本研究共选取了与KC相关的8 个SNP作为工具变量，并确保这些工具变量不受弱工具变量的影响（均F>10）。经过将特应性皮炎数据与KC数据进行匹配，最终纳入了8 个SNP作为工具变量（表2）。IVW的分析结果显示，KC与特应性皮炎之间不存在显著的风险关联（OR=0.98，95%CI：0.94～1.01，P=0.294）。加权中位数法（OR=0.97，95%CI：0.93～1.00，P=0.134）和MR Egger法（OR=0.97，95%CI：0.91～1.02，P=0.359）未能检测到KC与特应性皮炎之间的显著因果关系。敏感性分析表明，圆锥角膜与特应性皮炎之间的SNP不存在显著的异质性（CochranQ检验，Q=10.98，P=0.146）；MR PRESSO的结果显示未检测到异常的SNP（P>0.05）。散点图结果表明，与KC和特应性皮炎密切相关的SNP具有稳定性（图4）。漏斗图结果显示SNP呈对称分布，MR分析未显示多效性（图5）。MR Egger截距测试结果显示MR分析未呈现水平多效性（截距值为0.009，P=0.661）。通过“留一法”敏感性分析，未发现单个SNP对整体结果产生较大影响（图6）。

表2.与圆锥角膜有关的SNP信息Table 2.The SNP information associated with keratoconus

图4.圆锥角膜与特应性皮炎因果关系的散点图Figure 4.Scatter plot illustrating the causal relationship between keratoconus and atopic dermatitis SNP, single nucleotide polymorphism; MR, Mendelian randomization.

图5.圆锥角膜对特应性皮炎因果影响的漏斗图Figure 5.Funnel plot depicting the causal impact of keratoconus on atopic dermatitis βIV, the effect size of the allele; 1/SEIV, the standard error of the effect size of the allele; MR, Mendelian randomization.

3 讨论

既往的观察性研究表明，KC与特应性皮炎存在一定的关联。1977年发表在《英国眼科杂志》上的一篇文章指出，在KC患者中，约有35%表现出特应性倾向（包括花粉热、哮喘和湿疹），而在健康对照组中，仅有12%表现出这种倾向（P<0.001）[12]。40 年后，Thyssen等[13]对超过18 岁的丹麦人进行观察，发现重度过敏性皮炎患者患KC的风险比为10.01（95%CI：5.02～19.96）。最近的研究也发现，在特应性皮炎严重性评分（SCORAD指数）较低的患者中，未观察到KC的出现[14-15]。因此，可以推测KC可能发生在特应性反应的较晚阶段。

迄今为止，关于KC与特应性皮炎之间的因果关系仍不明确。本研究采用MR方法较准确地证明了特应性皮炎能增加KC的发生风险，但是，并不能证明KC能增加患特应性皮炎的风险。

本研究从遗传的角度证实特应性皮炎是KC的风险因素。尽管尚不清楚特应性皮炎如何发挥这种作用，但过去的研究提出了几种潜在机制。首先是揉眼。据推测，KC在特应性皮炎中的发病率较高，可能与眼部瘙痒等不适引起的机械性揉眼有关[3]。已有研究证明眼部擦揉与KC之间存在联系[16]。还有研究提出，眼睛摩擦导致KC的原因包括角膜受热、炎症介质在泪液中的释放、酶活性增加、眼压的升高、角膜细胞变化以及角膜剪切强度降低或临时位移[17]。其次，炎症和免疫反应也是特应性皮炎导致KC发生的一种可能机制。特应性皮炎和KC都涉及异常的炎症和免疫反应。特应性皮炎是一种慢性炎症性皮肤病，与免疫细胞和炎症介质的异常激活有关。KC的发展过程涉及角膜层的炎症和细胞变化，这可能与特应性皮炎引起的全身性炎症反应有关[18]。此外，遗传因素也可能起到一定的作用。研究表明，特应性皮炎和KC可能共享一些遗传变异，包括与细胞骨架、细胞外基质和细胞黏附相关的基因[19]。

本研究首次采用MR方法来探索特应性皮炎与KC之间的因果关系。尽管之前已经有许多观察性研究关注这一关系，但这些研究可能存在伦理问题，并且即使在调整了相关变量的情况下，仍可能存在未知变量引起的偏倚。而通过采用MR方法可以最大限度地减少观察性研究的局限性。

本研究也存在一些局限性。首先，由于研究数据都来自欧洲血统的人群，因此研究结果不能代表真正随机的人口样本，也不适用于其他种族。其次，尽管本研究已进行了各种敏感性分析来验证MR研究的假设，但仍难以完全排除工具变量的水平多效性。最后，目前的GWAS数据样本量仍不够充足，如本研究所用的KC GWAS数据只包含311个病例，样本数量偏少，未来需要使用更多的GWAS数据进行更深入的研究。

本研究使用双向MR方法，研究结果表明特应性皮炎与KC的风险增加存在显著的因果关系。相反，没有证据支持KC会增加或减少特应性皮炎的风险。本研究认为特应性皮炎是KC的易感因素，通过潜在的病理生理机制促进了KC的早期发病。因此，我们强调早期宣教的重要性，并提出了2项合理的建议：一是增加特应性皮炎患者进行角膜厚度及角膜地形图等检查的频率，有利于更早发现KC；二是考虑更早的干预措施，以防止KC的进一步发展。

利益冲突申明 本研究无任何利益冲突

作者贡献声明 魏熙翔：收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。杨晖：参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行核修。尹雪：参与选题、设计和修改论文的结果、结论，根据编辑部的修改意见进行核修。傅征、熊薇薇：参与选题，根据编辑部的修改意见进行核修