十字花科蔬菜提取物对草莓专化型尖孢镰刀菌的抑菌活性研究

王海琪，史芳芳

（新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所，新疆 乌鲁木齐 830088）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）为蔷薇科多年生草本植物，富含营养物质，果实味道甜美，生育期短，结果早和产量高，备受人们喜爱，具有较高的经济价值。近些年来，草莓产业发展迅速，但是由于种植面积不断扩大、种植连作等原因，导致草莓土传病害严重[1]。尖孢镰刀菌为一类可在土壤内生存又可侵染作物的兼性寄生真菌。由尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum Schl.f.sp.fragariae）侵染引起的枯萎病是引起连作草莓普遍发生的重要土传病害，严重制约了草莓的可持续发展[2-3]。目前生产上大量使用化学杀菌剂防治草莓枯萎病，导致病原菌抗药性及农药残留等问题加剧，对生态环境和食品安全造成了极大危害，因此探索有效防控草莓枯萎病的生物方法刻不容缓。

十字花科蔬菜具良好的化感作用[4]，将十字花科芸薹属蔬菜的植株残体翻埋进土壤，具有改善土壤质量、提高土壤微生物多样性、促进草莓生长的作用，同时还可降低土壤中有害真菌数量，减少枯萎病的发生。王德江等[5]通过研究4 种芸薹属蔬菜生物熏蒸对黄瓜枯萎病的影响，发现4 种蔬菜提取液对枯萎病病菌的生长均有抑制作用，其中芥菜生物熏蒸处理防病效果达到52.9%。刘琳等[6]、刘琼等[7]研究发现，芥菜和茼蒿蔬菜提取物可抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌，有效抑制菌体生长，抑菌率可达90%。十字花科蔬菜属于新疆常见作物，且其体内化感效应对改善土壤质量有明显效果，因此本研究选取十字花科蔬菜探讨对连作草莓普遍发生枯萎病的影响。

本研究对所采集的草莓病株进行病原菌分离、培养、鉴定，通过DNA 鉴定出草莓专尖孢镰刀菌导致的草莓枯萎病，对分离出的病原菌进行药剂试验；并采用菌丝生长法测定5 种十字花科蔬菜对草莓专化型尖孢镰刀菌的室内毒力，筛选其杀菌活性，旨在为草莓枯萎病防治和蔬菜源农药先导化合物的研发提供技术依据。同时利用十字花科蔬菜之间的化感作用合理安排与草莓轮、间作[8]，可改善土壤微生物结构，减轻病害发生。

1 材料及方法

1.1 试验时间、地点

试验于2023 年5 月在新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所组培室进行。

1.2 材料与试剂

蔬菜：采用种植于新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所冷棚的芥菜、茼蒿、甘蓝、油菜和雪里蕻，经风干后用小型粉碎机制成粉末状样品，过40 目筛，放置于密封袋备用。

供试菌株： 尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum Schl.f.sp.fragariae） 采自十二师农科所草莓种苗繁育基地，通过采集病株分离、纯化、DNA 鉴定后，经柯赫氏法则验证并保存的菌种。

试剂PDA（potato dextrose agar）培养基、95%乙醇、注射用氨苄青霉素钠，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 仪器与设备

超净工作台（JBVS 840 型），苏州佳宝净化工程设备有限公司；电子天平（PL203），Mettler Toledo；电热恒温培养箱（DHP-9080B 型），上海琅玕实验设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（LDZH-200KBS 型），上海申安医疗器械厂；氮吹仪（CM-24T），北京成萌伟业技有限公司；粉样机，小熊磨粉机；90 mm、培养皿，移液枪，镊子、接种刀、50 mL 离心管等。

1.4 试验方法

1.4.1 蔬菜提取液的制备

准确称取10.0 g 芥菜、茼蒿、甘蓝、油菜和雪里蕻粉末各3 份，分别加入10 倍体积的95%乙醇，浸提24 h，并用超声波辅助提取2 h，过滤提取液，使用氮吹仪（50 ℃）浓缩至10 mL，制成浓度为1.0 g/mL 的芥菜、茼蒿、甘蓝、油菜和雪里蕻提取物溶液，4 ℃保存备用。

1.4.2 氨苄青霉素钠溶液的配制

称取氨苄青霉素钠0.5 g 置于50 mL 离心管中，定容并配制成浓度为10 mg/L 氨苄青霉素钠溶液。

1.4.3 不同蔬菜提取物的抑菌活性

将1.0 g/mL 芥菜、茼蒿、甘蓝、油菜和雪里蕻提取物分别稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 g/mL 的不同浓度溶液，无菌条件下与培养基混合制成含药平板，同时加入浓度为10 mg/L 的氨苄青霉素钠溶液（抑制细菌生长），以多菌灵作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。无菌条件下，将供试病菌接种至PDA 培养基后，于28 ℃培养箱中恒温暗培养5 d，待菌种长满平板时，在菌落边缘处打取直径为7 mm 的菌饼备用。

1.4.4 蔬菜提取物对西瓜枯萎病菌的室内毒力测定

取制备好的菌饼接种于含药培养基中央，重复3 次。放入28 ℃培养箱中培养7 d，采用十字交叉法测量菌落直径[9]，按照公式（1）（2）计算菌落直径和抑菌率。

1.5 数据分析

利用Excel 2010 和SPSS 20.0 进行数据处理，Duncan和LSD 进行多重差异分析，采用DPS 7.05 制图。

2 结果与分析

2.1 不同蔬菜提取液的抑菌活性

由图1～2 可以看出，随不同蔬菜提取液浓度的降低，抑菌率呈现出随之降低的趋势，其中0.4～1 g/mL 对尖孢镰刀菌有明显抑制作用，浓度大于0.8 g/mL 时，抑菌率均大于50%；蔬菜提取液浓度为0.05～0.2 g/mL 的抑菌效果不明显，浓度为0.05 g/mL 时抑制作用接近于4%。不同浓度下各蔬菜提取液对尖孢镰刀菌抑菌效果差异明显，在高浓度下以茼蒿和芥菜抑菌效果最好，浓度在1 g/mL 时，茼蒿和芥菜抑菌率最高，显著高于甘蓝、雪里蕻、油菜，分别高12.58%、3.89%、3.42%和12.08%、3.56%、2.96%。

图1 不同浓度的蔬菜提取液对菌丝生长的影响Fig.1 Effect of vegetable extracts with different concentrations on mycelial growth

图2 不同浓度蔬菜提取液对尖孢镰刀菌的抑菌率Fig.2 Antibacterial rate of vegetable extracts with different concentrations against F.oxysporum

2.2 5 种蔬菜提取物对尖孢镰刀菌的室内毒力测定

以茼蒿、甘蓝、芥菜、雪里蕻、油菜5 种蔬菜提取液的浓度为横坐标，以抑菌率为纵坐标，得出5 种蔬菜提取物对草莓尖孢镰刀菌的毒力回归方程及EC50、斜率、相关系数等。EC50是衡量药剂毒力大小的重要指标，其EC50值越大，表明该药剂毒力越小；反之，则表明药剂毒力越大[10]。

由表1 可以看出，茼蒿的EC50为0.413 0 g/mL，说明茼蒿提取液毒力大，对尖孢镰刀菌抑制效果最好，芥菜、雪里蕻和油菜EC50在0.473 5～0.491 5 g/mL 之间，说明这三种蔬菜提取液毒力相当，甘蓝的EC50最高，对病原菌抑制作用最低。毒力回归方程的斜率k 代表了病菌对杀菌剂的敏感性，斜率k 越大，敏感性越高，反之，敏感性越低[11]。表1 中可以看出茼蒿、雪里蕻、油菜3 种蔬菜斜率k 较大，说明尖孢镰刀菌对这3 种蔬菜敏感性较高，病原菌对甘蓝敏感性较低。

表1 不同蔬菜提取液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of different vegetable extracts on the growth of F.oxysporum hyphae

3 结论

目前生产上防控草莓枯萎病多采用化学防治方法，如百菌清、代森锰锌和多菌灵等，但化学防控越来越难以满足草莓产业的健康发展需求，因此急需探索对草莓枯萎病防控的生物防治方法，已有不少研究关于蔬菜中的挥发油和萜类化合物等对病害病原菌具有抑制和杀灭作用[12-14]。本研究通过菌丝生长法测定，发现5 种十字花科蔬菜提取液均对草莓专化型尖孢镰刀菌有一定的抑菌效果，但不同蔬菜提取液抑制作用不同，蔬菜提取物对尖孢镰刀菌的最佳抑制浓度为1 g/mL，此浓度下5种蔬菜抑菌活性大小依次为茼蒿、芥菜、油菜、雪里蕻、甘蓝，这与刘琳等[6]发现芥菜提取物对西瓜枯萎病的抑制浓度相当。5 种十字花科蔬菜提取液中茼蒿、油菜、雪里蕻和芥菜对尖孢镰刀菌具有较强的毒力，EC50值分别达到了0.413 0、0.473 5、0.474 9、0.491 5 g/mL。综合发现，茼蒿提取液对草莓枯萎病的抑制作用最好，这与李珊珊等[15]研究结果相似，她认为茼蒿中含有的绿原酸能抑制西瓜枯萎病病原菌菌丝生长，降低病菌孢子萌发率。十字花科芸薹属蔬菜是中国栽培面积最大、消费量最大的蔬菜，因此研究生物质体内活性物质对蔬菜病害的抑菌效果有重要的现实意义，田间可通过茼蒿等十字花科蔬菜与草莓轮作进行草莓枯萎病的防治，后续可采集轮作后蔬菜与土壤酚酸类物质进行研究，进一步探索十字花科蔬菜对枯萎病病原菌的化感作用，为今后研发生物杀菌剂提供理论依据。