基于UPLC-Q-TOF-MS 的马蹄地上茎化学成分分析

魏 佩，陈 思，高紫珊，敬思群*，萧雅泳，谢镇蔚，刘根梅，华军利，刘桂枝

（1.韶关学院食品学院，广东 韶关 512005；2.韶关乐昌北乡镇东莞驻镇工作队，广东 乐昌 512200）

马蹄（Eleocharis dulcis（Burm.f.）Trin）属于莎草科马蹄属水生植物，学名荸荠，又名地栗、乌芋、凫茨、通天草等，因外形似马蹄而得名[1]。马蹄球茎营养丰富，有“地下雪梨”“江南人参”等美称。据测定，每100 g 鲜品中，含水分68 g、碳水化合物21.8 g、蛋白质1.5 g、脂肪0.1 g、粗纤维0.5 g，还含有钙、磷、铁、胡萝卜素、维生素B1、维生素B2、维生素C、尼克酸等[2-3]。关于马蹄的研究大多集中在马蹄球茎[4-6]和马蹄皮[7-9]的化学成分、采后贮藏保鲜、活性成分与功能作用及功能基因研究等方面。魏荣锐等[10]从荸荠乙酸乙酯部位分离并鉴定了16 个苯丙素类化合物，结果发现其对细胞损伤具有一定的保护作用；何纤等[11]利用超声波提取法制备马蹄皮多酚，发现马蹄皮多酚可抑制大鼠红细胞溶血，对大鼠超氧阴离子自由基、羟基自由基有极强的清除作用。李红侠等[12]采用超声辅助提取荸荠皮中的总黄酮，发现其具有较好的抗氧化活性。上述研究多侧重于马蹄球茎和马蹄皮，关于马蹄地上茎研究鲜见报道。《本草纲目》中记载，马蹄的地上茎在中药上称“通天草”，有清热利尿等作用。Jing 等[13-14]研究发现与马蹄同科的植物油莎草地上茎叶总黄酮有显著的抑菌性、抗氧化性、干预缺血性脑中风等生物活性，于是推测马蹄地上茎有潜在的开发价值。然而目前地上茎大多用于饲料或丢弃，造成资源的浪费，并引发环境污染问题。因此，开展地上茎高值化利用研究有实际意义。

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法（Ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS） 结合了超高效液相色谱和高分辨质谱的优点，是一种快速、灵敏度高、分离能力高、准确的数据采集技术，被广泛地应用于中药复杂化学成分的结构鉴定。王茂媛等[15]采用UPLC-Q-TOF-MS 技术对益智种子和果皮乙醇提取物的非挥发性成分进行了分析；蔡定吉等[16]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术研究紫丁香的化学成分。目前尚未见此技术用于马蹄成分分析的报道。本文采用UPLC-Q-TOF-MS 法对马蹄地上茎化学成分进行快速分析，基于强大精确的质谱分析平台和ChemSpider 在线检索数据库，结合文献报道信息，综合化合物相应结构特征、精确相对分子质量和质谱裂解规律，对化学组分进行识别鉴定，以期为进一步阐释其药效物质、作用机制及高值化开发利用方式提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

干燥的马蹄地上茎，由广东省韶关市乐昌北乡桂源马蹄流通合作社提供。

乙腈（质谱纯），美国Fisher 公司；甲酸（质谱纯），德国Merck Millipore 公司。

Q Exactive Plus Orbitrap 高分辨液质联用仪，Thermo Fisher 公司；电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9146，上海锦赋实验仪器设备有限公司；U3000 超高效液相色谱及自动进样器，美国Thermo Fisher 公司；Vortex-2 Genie 涡旋混合器，美国Scientific Industries 公司；5810R 低温离心机，中国Eppendorf 公司；WD-9415C 超声波清洗器，北京市六一仪器厂；ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），美国Waters 公司。

1.2 方法

1.2.1 化学成分分析

按照GB 5009.5—2016 第一法测定蛋白质含量[17]；按照GB/T 5009.10—2003 测定粗纤维的含量[18]；按照GB 5009.268—2016 第一法、GB 5009.268—2016 第二法，采用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定矿物元素的含量[19]；按照NY/T 1295—2007 测定马蹄地上茎总黄酮含量[20]；按照GB/T 8313—2018 第四法测定茶多酚含量[21]。

1.2.2 UPLC-Q-TOF-MS 技术分析马蹄地上茎化学成分

（1）样品预处理

取马蹄地上茎200 mg，冷冻研磨，在真空度150 Pa、-43 ℃下真空冷冻干燥56 h。加入10 mL 50%甲醇水溶液，超声30min，取上清液1mL置于离心管，14000 r/min 离心5 min， 取上清液过0.22 μm 微孔滤膜后，待UHPLC-MS/MS 分析。空白样品采用相同条件处理。

（2）液相条件

色谱柱：ACQUITYUPLCHSST3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱温：35 ℃，进样体积：10 μL，流速：0.3 mL/min，流动相：A（去离子水，含0.1%甲酸）；B（乙腈，含0.1%甲酸），梯度洗脱，0→10→25→30→40→45 min，A 分别70%→70%→60%→50%→30%→0。

（3）质谱条件

采用Q Exactive Orbitrap 高分辨质谱进行质谱数据采集，检测模式为Full MS-ddMS2，正离子和负离子模式分别扫描，扫描范围为m/z 100～1 200，MS1 分辨率设置为70 000，MS2 分辨率设置为17 500，离子源电压为3.2 kV，毛细管离子传输管温度为320 ℃，辅助气加热温度为350 ℃，鞘气流速为40 L/min，辅助气流速为15 L/min，AGC Target 设置为1e6，TopN 设置为5，触发MS2扫描的碰撞能量采用阶梯式碎裂电压NCE，设置为30、40、50。

1.3 数据处理

应用LC-MS 液质联用仪采集数据，进行马蹄地上茎化学成分的定性分析。采用Compound discover 3.2 进行原始Raw 质谱数据特征峰提取，特征峰元素匹配、分子式预测及同位素分布匹配的质量偏差均设置为5×10-6以内。采用mzcloud 在线数据库和本地自建mzVault 中药天然产物数据库进行特征峰鉴定，阳性结果筛选标准为质量偏差小于5×10-6，符合同位素分布及mzVault best match 数据库匹配得分大于70 分。经过手动确认和重复结果剔除后即得到化合物信息。

2 结果与分析

2.1 马蹄地上茎化学成分分析

由表1 知，马蹄地上茎含蛋白质11.2%（苜蓿14%[22]）、粗纤维26.0%，矿物元素锰126 mg/kg、钾2.46×104mg/kg、钙3.22×103mg/kg、硒0.079 6 mg/kg，可作为优质饲料。

表1 马蹄地上茎化学成分Table 1 Chemical composition of stems of water chestnut

2.2 马蹄地上茎UPLC-Q-TOF-MS 测定

离子在电场中加速，在磁场中偏转。正离子源适用于碱性化合物，由于含氮化合物更容易黏附氢正离子，在正离子源中容易出分子离子峰。负离子源适合酸性化合物，由于酸性化合物更容易轰击掉氢正离子，如酸、酚类化合物。实验分别采用正负离子模式下同时分析可以全面反映马蹄地上茎的化学成分，结果见图1、2。

图1 正离子模式下的马蹄地上茎BPI 色谱图Fig.1 Base peak chromatograms (BPI) with positive ion mode of stems of water chestnut

图2 负离子模式下的马蹄地上茎BPI 色谱图Fig.2 Base peak chromatograms (BPI) with negative ion mode of stems of water chestnut

通过与对照品、文献和自建数据库信息相比对，对马蹄地上茎总离子流图中的各离子峰进行鉴定，分析化合物的保留时间、精确相对分子质量和碎片离子信息，结合质谱裂解规律共推测出66 个化学成分，其中包括30 个黄酮类（41.342%）、4 个生物碱类（24.089%）、15 个有机酸类（20.896%）、7 个酯类（8.185%）、2 个蒽醌类（3.081%）、4 个醛类（1.375%）、2 个醇类（0.544%）、1 个苯丙素类（0.125%）和1 个其他成分（乳糖，0.362%），见表2。

表2 马蹄地上茎化学成分的UPLC-Q-TOF-MS 鉴定结果Table 2 Identification of chemical constituents from stems of water chestnut by UPLC-Q-TOF-MS

由表2 可知，马蹄地上茎生物活性成分主要是黄酮类，其次是生物碱和有机酸。黄酮类化合物有棕矢车菊素（25.607%）、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷（3.488%）、芹菜素（2.720%）、木犀草素（2.568%）、葛根素（0.784%）等10 种化合物，生物碱有甜菜碱（11.683%）、水苏碱（6.570%）、左旋肉碱（4.919%）、盐酸胡芦巴碱（0.917%）。棕矢车菊素[23]、芹菜素[24]、木犀草素[25]具有抗癌和抗炎作用，能够降低炎性因子水平；橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷[26]、葛根素[27]等具有抗氧化、抗动脉粥样硬化以及增强免疫力等药理活性；甜菜碱具有抗炎作用而预防肝脏损伤[28]；水苏碱具有改善微循环、抗纤维化、抗炎、神经保护等生物活性[29]。综上，开展对马蹄地上茎活性成分的开发利用有一定的可行性，尤以黄酮类成分为主，在后期研究予以特别关注。

3 结论

马蹄地上茎主要化学成分为蛋白质11.2%、粗纤维26.0%，还含有总黄酮（0.42）%、茶多酚（1.4%），可作为优质饲料。UPLC-Q-TOF-MS 技术分析马蹄地上茎得到66个化学成分，其中包括30 个黄酮类、4 个生物碱类、15 个有机酸类、7 个酯类、2 个蒽醌类、4 个醛类、2 个醇类、1个苯丙素类和1 个其他成分（乳糖），马蹄地上茎生物活性成分主要是黄酮类（41.342%）， 其次是生物碱（24.089%）、有机酸（20.896%），可作为具有抗炎和抗癌作用天然药物资源，为进一步深入研究该植物清热利尿作用的活性部位、寻找其药效物质、阐明作用机制奠定了基础，同时为马蹄地上茎高值化利用提供了科学依据。