矿化胶原材料的制备、调控及矿化机制研究进展

田振华, 赵文杰, 高盼盼, 何静瑄

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院, 陕西 西安 710021; 2.陕西科技大学 轻化工程国家级实验教学示范中心, 陕西 西安 710021; 3.兴业皮革科技股份有限公司, 福建 泉州 362000)

0 引言

近年来,随着我国人口老龄化和饮食结构的改变,与骨相关的健康问题日渐凸显,比如骨缺损、骨质疏松.虽然自体骨存在一定的自修复功能,但对于骨内富集或残留毒素引起的骨髓坏死或干细胞分化干扰、大尺寸的骨缺损、骨质疏松等问题,自体骨因其较低的内源性自我修复能力不能实现完全修复,这些硬组织损害和疾病所带来的危害往往是不可逆的[1].因此为了保证骨组织快速再生并恢复其失去的功能,需要硬组织替代生物材料的植入辅助骨修复作用[2].

骨组织是一种复杂的生物矿化材料,具多级微纳米结构,其基本单位是由有序的Ⅰ型胶原纤维和羟基磷灰石(HAP)组成的矿化胶原支架.其中,Ⅰ型胶原构成骨支架并赋予其弹性与韧性;HAP作为无机质,提供刚度[3,4];此外,胶原纤维所具有的多重原纤结构为骨组织的等级结构奠定了基础,HAP和胶原纤维在分子水平上呈现有机-无机界面的识别和嵌合,这种严格的等级结构和不同元素的紧密相互作用构成了更优越的机械性能[5].天然骨组织所具有的独特形态和功能,为仿生矿化胶原材料的开发提供了示范.

胶原纤维具有独特的四分之一错列结构,纤维轴向上首尾相邻的分子间存在约40 nm的空隙区,平行排列的分子间存在0.24 nm的间隙.在矿化胶原材料的制备过程中,此结构作为模板,引导无机质有序沉积在胶原纤维内的这些空隙中并进一步结晶与生长,沿纤维长轴排列形成有序的分级层次结构(如图1所示)[6-9].矿化胶原材料具有与天然骨骼相类似的多级结构,可为骨细胞提供合适的微环境,且胶原具有促进骨细胞黏附、迁移、增殖和分化等生物学功能,有利于新骨的形成且其三维立体结构可为新骨的生长提供支架[10];作为骨组织代谢所必须的营养成分,能为骨修复提供能量和原料,其高孔隙率有利于承载细胞与信号分子并保证养分的传输和废物的排泄通畅[11];可根据需要加工成各种形状和大小,手术中易于修整,具有一定的机械强度,在必要时材料本身可提供机械支持.此外,矿化胶原材料还具有低免疫原性、良好的生物相容性及生物可降解性等优势,作为修复骨缺损和促进骨融合的骨修复材料具有广阔的应用前景,成为了当前生物矿化领域及骨修复领域的关注点[12].

图1 胶原纤维的结构及胶原纤维内矿化示意图[9]

在胶原矿化过程中,需要三大因素参与:胶原纤维作为矿化模板提供支架结构;矿化液作为无机质形成的主体原料;非胶原蛋白(NCPs)及其类似物作为诱导剂稳定并诱导矿化液的浸润与沉积.基于此,目前对于矿化胶原材料的研究重点在于新型矿化胶原材料的开发、矿化胶原材料结构的调控以及矿化机制的探索.例如,矿化材料已从最初的钙化胶原扩展到硅化、铁化胶原等;诱导剂种类、用量及矿化pH等因素对胶原的矿化过程、矿化程度等有所影响.因此,本文综述了矿化胶原材料的种类及制备,并对其矿化过程中的调控因素和机制作了阐述,就该材料的研究方向及其在骨修复领域中的应用前景进行了简要的讨论与展望.

1 矿化胶原材料的种类及其制备

最初,对于矿化胶原材料的研究主要集中于对天然骨成分及结构的仿生,通常是利用无定形碳酸钙或磷酸钙前体失水在纤维内或纤维外实现矿化所得到的钙化胶原材料.随着矿化技术及机制的发展,研究者们为了赋予矿化材料更多的功能性(如促成骨作用[13]、抗菌性[14]、组织诱导性[15]等),不断扩大无机质的选择范围、寻求新型诱导剂或创新制备方法.在矿化胶原材料的制备中,无机质从HAP逐渐发展到硅、钛等其他无机材料,诱导剂由最初的NCPs及其类似物如骨钙素、聚天冬氨酸(PAsp)、聚丙烯酸(PAA)扩充至天然多糖如海藻酸钠、硫酸软骨素、羧甲基壳聚糖等,使得矿化材料种类多样化、功能丰富化.目前矿化胶原材料主要包括钙化[16,17]、硅化[18-21]、钛化[22]、锆化[15]、铁矿化[23-25]以及多相矿化[26,27]胶原.

1.1 钙化胶原材料

受天然骨成分的启发,钙化胶原材料即HAP矿化胶原对成骨细胞的表达起着一定作用,是骨修复材料最有潜力的候选生物材料之一,也是至今研究最多的一类矿化胶原材料.研究者们最初均以胶原/HAP材料为基础对矿化胶原材料的制备方式以及矿化机制进行探讨.因此模拟天然骨的成分和结构特征在体外制备钙化胶原材料是当前发展矿化胶原材料的基石[28].

胶原/HAP复合材料制备通常有两种方式,其中一种是直接将胶原浸泡在模拟体液(SBF)中用于提高植入物的生物相容性;另一种是将胶原纤维和钙磷盐共沉淀自组装制备,使得钙化胶原材料具有与骨相同的层次结构.SBF溶液以及钙磷盐虽然提供了矿化所需要的离子资源,但HAP在纤维内的形成是不可控的,通常需加入适当的诱导剂以稳定前驱体溶液,进而诱导HAP在胶原纤维内部沉积形成纤维内矿化[29].常用诱导剂主要有NCPs类似物如PAsp、PAA、聚谷氨酸等,此类物质含有大量的羧基,可结合钙离子以防止前驱体溶液发生纤维外沉淀而促进纤维内矿化.其中,PAsp是应用最广泛的钙化诱导剂.Bradt等[30]采用胶原自组装与磷酸钙形成同步法制备了钙化胶原纤维并首次指出PAsp可改善胶原纤维与磷酸钙晶体之间的附着,在促进纤维内矿化中具有重要作用.

除上述NCPs类似物外,带有大量负电荷基团的生物大分子(如海藻酸钠、羧甲基纤维素)亦可作为诱导剂.Su等[31]将不同量的NaH2PO4和CaCl2依次滴入胶原/海藻酸钠混合液成功制备钙化胶原材料,并研究了海藻酸钠的作用.结果表明海藻酸钠不仅可以捕获Ca2+并且可促使胶原纤维的横向聚集;当海藻酸钠存在且HAP的理论含量为60%时,实现了纤维内矿化且效果最好,钙化胶原材料具有最佳的机械性能,有望应用于骨再生领域.

1.2 硅化胶原材料

硅矿化支架最早发现在海洋玻璃生物体中,为后续合成有机-纳米硅复合材料开辟了新的道路[32].其中,硅元素是人体内的主要微量元素,而二氧化硅(SiO2)纳米颗粒具有潜在的刺激骨相关基因表达和细胞增生的能力.

在硅基胶原复合材料开发初期,其主要以硅-胶原杂化体的形式存在.Coradin等[33]选用硅酸盐溶液作为前驱体溶液,与胶原溶液共混后在氨蒸汽下凝胶化合成了胶原-硅生物杂化体,发现硅酸盐和胶原浓度对产物形态具有很大影响;当硅酸盐与胶原的浓度分别为15 mg/mL和5 mg/mL时,可形成同质均匀的胶原/SiO2纤维.然而,胶原的自组装动力学和SiO2聚合动力学并不完全兼容,使得材料稳定性和可控性较差.Niu等[13]选用氯化胆碱稳定的硅酸作为前驱体溶液、经聚(烯丙胺)盐酸盐(PAH)处理过的胶原纤维为模板,成功实现了SiO2纳米颗粒在胶原纤维内的矿化沉积.该硅化胶原材料具有促成骨和血管增长的潜力,但缺乏细胞归巢、可生物降解性及高度相容性.后续研究中,作者在硅化过程中同步引入了基质细胞衍生因子SDF-1,不仅解决了上述问题,而且消除了细胞播种或补充成骨和血管生成生长因子的需要,该成果为原位硬组织再生提供了新的治疗方案[21].

1.3 钛化胶原材料

纳米二氧化钛(TiO2)具有良好的生物相容性、骨传导能力和优良的机械性质,可诱导HAP沉积,是机体发生骨整合的活性成份[34].利用仿生矿化的方法将TiO2引入胶原材料,有望制备具良好性能的骨修复材料.

许译文[22]采用具有催化硫酸氧钛水解和缩合作用的聚乙烯亚胺(PEI)预交联胶原,促使TiO2在胶原纤维内的沉积,成功制备了钛化胶原支架.TiO2通过表面羟基化诱导HAP的形成,赋予钛化胶原骨传导效应,有利于增强骨修复材料的再生能力以及缩短临床愈合时间.

1.4 锆化胶原材料

锆(Zr)是人体骨骼与组织的微量元素之一.研究发现Zr离子具有促成骨细胞增殖分化的作用,其氧化物即氧化锆(ZrO2)或金属合金复合支架在骨种植领域有潜在的应用前景[35].例如,ZrO2陶瓷材料不仅具有良好生物相容性和耐腐蚀性,而且以其机械强度和光学性能的非凡而闻名,广泛应用于人体组织修复领域,尤其是牙种植体.

Zhou等[15]采用乙酰丙酮抑制、钇稳定的氧化锆(YSZ)作为前驱体溶液,PAH交联胶原支架作为模板,借助PAH和胶原纤维中的水分子触发YSZ的水解缩合使无定形ZrO2纳米颗粒沉积在纤维内形成锆矿化胶原材料.如图2所示,YSZ进入胶原纤维后在PAH作用下聚结,形成尺寸更大的无定形前体聚集体;随后这些聚集体在水的催化下缩聚转变为无定形ZrO2纳米颗粒,沉积于胶原纤维内空隙中.该研究为开发融合具高机械强度氧化锆的天然胶原材料提供了新策略,具有作为人体受损硬组织替代物的潜在应用价值.

图2 YSZ在胶原纤维内沉积的过程示意图[15]

1.5 铁矿化胶原材料

含铁矿物在细菌、藻类、软体动物、昆虫和脊椎动物体中广泛存在.铁作为金属元素,一是依靠地磁场为进行生命或生理活动的生物提供“导航”;二是生物体可以吸收其转化为强化和保护自身器官或组织的化合物.常见的含铁矿物分为氧化物(磁铁矿)和氢氧化物(针铁矿、纤铁矿(γ-FeOOH)、水铁矿等).

目前,铁矿化胶原材料的研究主要集中于纤铁矿化类胶原材料.Xu等[23]将胶原海绵直接浸泡于FeCl3、FeCl2和PAsp溶液后置于饱和氢氧化铵环境中矿化24 h.经透射电镜观察仅有少量γ-FeOOH纳米颗粒存在于胶原纤维表面,而大部分存在于纤维外.随后,Oosterlaken等[24]采用仿生共沉淀法将碱滴定后的FeCl3和FeCl2溶液、PAsp溶液与胶原分散液依次混合制备了铁矿化胶原,PAsp存在时可发生纤维内矿化,反之则为纤维外矿化.矿化过程中首先形成Fe-PAsp复合物,随后转化为γ-FeOOH贯穿在胶原纤维内部.该矿化机制类似于HAp矿化胶原的机制,进一步证实了胶原纤维可以作为矿化的通用模板,但该方法下所观察到的γ-FeOOH晶体不成熟.后续研究中,Oosterlaken等[25]研究了原料加入方式、pH值、氧化等因素对铁矿化胶原的影响规律,发现先通过KOH溶液调节FeCl2溶液的pH至9合成Fe(OH)2中间体,再将其引入胶原纤维与PAsp混合液中,经氧化后可获得含有成熟γ-FeOOH晶体的矿化胶原纤维.此研究为铁矿化胶原材料的开发提供了理论指导,具有较高的参考价值.

此外,磁铁矿和磁铁矿基材料在癌症诊断和治疗中具有热疗、药物转运和靶向传递等优势[36],也有文献曾报道胶原/HAP/磁铁矿复合材料具有抗肿瘤、促进骨再生等作用,可用于骨癌治疗[37].

1.6 多相矿化胶原材料

自然界中天然生物矿化材料除单相矿化外,有些稀有生物的结构层次是由多相矿化组合而成,如软体动物的硅-几丁质-针铁矿齿舌、腕足类动物的硅-几丁质-磷灰石壳、桡足类动物的硅-几丁质-硅锌矿牙齿[38,39],此类矿化形式为新型多相矿化生物复合材料的开发提供了灵感.

Niu等[26]和Jiao等[27]将胶原支架依次浸泡于PAH稳定的硅酸、PAsp稳定的无定形磷酸钙矿化液(ACP)中,制备了双相SiO2/磷灰石共矿化胶原支架,并进一步研究了该材料在硬组织再生中的生物学应用.结果表明SiO2和磷灰石不仅赋予了胶原支架机械性能,而且在骨代谢中发挥了更具生物活性的协同作用.双相矿化材料刺激骨髓间充质干细胞的成骨分化的同时抑制了破骨细胞的生成.多相矿化胶原材料可集多种无机质的生物功能为一体,为多功能性矿化胶原的材料的开发提供了新的思路.

传统的矿化胶原材料制备工艺主要是利用诱导剂对矿化液进行稳定并诱导其进入胶原纤维内部,水解缩聚实现矿化.随着矿化液种类、诱导剂种类的增多及现有矿化技术的发展,制备工艺出现了转变,新型的制备工艺可分为以下两种:(1)胶原溶液先与矿化液、诱导剂共混,随后胶原的组装成纤过程与矿化液的水解缩聚过程同步化,实现矿化[19,24,31]; (2)诱导剂先进入胶原纤维内部,随后再浸入矿化液实现矿化[13,15,22].然而,这两种工艺的普适性不及传统制备工艺;此外,矿化胶原材料的种类与制备工艺之间的对应关系、制备工艺对最终矿化胶原材料的结构与性能产生何种影响尚无明确的规律性结论,需进一步探究.

2 矿化过程中的调控因素

胶原纤维的矿化主要依赖于诱导剂稳定矿化液,控制其尺寸并诱导其进入胶原纤维内部实现矿化.因此,矿化液、诱导剂及矿化条件对胶原的矿化过程具有显著的调控作用.

2.1 矿化液浓度

在胶原矿化过程中,在诱导剂的作用下矿化液进一步结晶或者水解缩聚形成矿物沉积在胶原纤维内.矿化液的浓度会影响所形成矿物质的形貌及沉积量,进而影响矿化材料的性能.

Zhao等[40]将胶原/壳聚糖支架先分别浸泡于0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.25 mol/L、0.5 mol/L CaCl2溶液,再分别滴入不同浓度(0.03 mol/L、0.06 mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L)的 (NH4)2HPO4溶液,制备了矿化胶原/壳聚糖支架并检测了其微观结构与性能.结果表明,当CaCl2浓度为0.05 mol/L,HAP呈现针状;随CaCl2浓度的增加,HAP呈球形且粒径从100 nm增加至200 nm.此外,随CaCl2浓度的增加,材料中HAP含量提高,进一步使得材料的热稳定性与储能模量提高.

2.2 诱导剂

诱导剂(NCPs及其类似物)不但对矿化前驱体溶液有稳定作用,而且进一步诱导其渗入胶原纤维内部发生结晶、完成纤维矿化,在胶原纤维矿化过程中的作用举足轻重.鉴于NCPs富含羧基的特性,许多阴离子型化合物如PAsp[41]、PAA[42]、柠檬酸盐[43]、羧甲基壳聚糖[44]、海藻酸钠[31]、硫酸软骨素[45]等可作为NCPs类似物调控体外生物矿化过程.而诱导剂的种类、浓度、分子量等均会对矿化行为产生不同影响.

2.2.1 诱导剂种类

骨桥蛋白(OPN)是一类含有重复天冬氨基酸残基序列的NCPs,广泛存在于骨的细胞外基质中,与骨的形成和发展密切相关.Saxena等[46]评估了OPN和PAsp对胶原矿化的影响.研究发现,OPN存在时,胶原海绵在矿化6 h时存在大量的矿物(62.9%±2.1%);而PAsp存在时,海绵的矿化速度较慢,6 h时矿物含量仅有14.2%±2.1%,在18 h时才能达到与OPN相接近的矿物质含量.由此可知,OPN能更快、更均匀地诱导磷灰石的形成且胶原纤维内矿化程度较高,在加工仿生骨替代品方面有更显著的优势.

2.2.2 诱导剂浓度

柠檬酸可以有效补充骨密度,是一种广泛用于骨质疏松症的药物.矿化胶原中柠檬酸的作用体现在改善骨生成和骨相关疾病的治疗.Shao等[47]通过比较不同浓度柠檬酸盐对胶原矿化程度的影响,研究了柠檬酸盐促骨形成的机理.如图3所示,柠檬酸盐不仅提供了羧基成核位点和磷酸钙矿物相的结合位点,而且可通过减少ACP与胶原间的界面能以促进异相成核,增强了胶原和无机相的整合及矿化程度.当柠檬酸盐浓度接近天然骨胶原中柠檬酸水平即超过8 wt%时,矿化胶原中HAP与胶原的重量比接近3.0,达到天然骨骼的水平,且该浓度下胶原纤维达到了完全润湿(如图3所示);相比之下,未进行处理的胶原中HAP与胶原的重量比仅为2.5.因此,柠檬酸盐的加入增加了矿化胶原中的总矿物质HAP含量,可显著提高胶原的矿化程度.

图3 柠檬酸盐浓度对胶原矿化程度的影响[47]

2.2.3 诱导剂分子量

Shen等[42]研究了PAA分子量(2 kDa、100 kDa、450 kDa)和浓度(40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L)对胶原矿化的影响.结果表明胶原的矿化程度双重依赖于聚合物的分子量和浓度(如图4所示).低浓度的高分子量PAA无法稳定ACP导致纤维外矿化,高浓度的低分子量PAA的稳定作用过强导致矿化速率过慢.只有在低浓度的2 kDa PAA和较高浓度的100 kDa和450 kDa PAA下才能有效延缓ACP的结晶,从而诱导纤维内矿化;此条件下,矿化胶原中HAP含量达到约40%,与天然骨中矿物含量相近.此外,矿化材料中所含Ca和P含量随着PAA分子量的提高或PAA浓度的降低而增加,但其Ca/P比范围为1.63 ～ 1.74,与天然骨(1.67)相近.

图4 PAA分子量和浓度对胶原矿化的影响[42]

2.3 矿化条件

2.3.1 矿化pH值

鉴于部分NCPs及其类似物的两性聚电解质特性,pH值对于调节胶原矿化有重要的作用.例如,羧甲基壳聚糖(CMC)作为两性聚电解质同时具有羧基和氨基,可分别作为低于或高于其等电点的阴离子或阳离子聚电解质.

CMC作为两性聚电解质同时具有羧基和氨基,可分别作为低于或高于其等电点的阴离子或阳离子聚电解质.Lin等[48]发现带负电荷的CMC(pH 7)捕获ACP溶液中带正电荷的Ca2+稳定ACP纳米粒子,并通过胶原先组装后矿化的模型促进纤维矿化,符合传统所认可的MFS矿化机制(如图5所示);而当pH值为2时,带正电荷的CMC捕获ACP溶液中带负电荷的磷酸根离子来稳定ACP纳米粒子,然后通过同步自组装/矿化的方式整合在胶原纤维内,此矿化机制(SSM模型)的发现为开发矿化胶原支架材料提供了一种新的策略.

图5 矿化液在不同pH下的胶原矿化示意图[48]

2.3.2 矿化时间

胶原矿化是一个受时间调控的过程,该过程包括前驱体溶液浸润胶原纤维以及矿物结晶沉积在纤维内.Dai等[49]借助三聚磷酸钠的负电性与带正电的胶原间隙相结合,产生了相应的矿化位点,利用PAA诱导胶原纤维产生了周期性的纤维内矿化.如图6所示,24 h前是ACP浸润阶段,表现为磷酸钙前核簇周期性附着在胶原纤维表面(开放箭头);48 h发生了部分矿化,可检测出低结晶磷灰石;72 h后,具有周期性纤维内磷灰石沉积的矿化胶原纤维形成.表明胶原矿化是一个受时间调控的过程,随着时间的推移,矿物质的密度越大,矿化效果越明显.

图6 不同矿化时间下胶原纤维的TEM图[49]

在胶原纤维的矿化过程中,可根据多重因素的不同作用调控胶原的矿化程度、元素的含量及比例从而得到不同性能的矿化胶原材料.然而,目前对于胶原矿化的调控因素主要集中于矿化液和诱导剂.胶原模板虽然作为矿化所必需的三大因素之一,但目前关于胶原纤维结构如胶原直径等对胶原矿化过程的影响未有系统性的研究,有待进一步探讨.

3 胶原纤维的矿化机制理论

生物矿化是一个普遍存在且严格调控的过程,它为骨骼创造了层次结构.了解胶原纤维矿化的原理、过程、调控机制,对骨组织再生材料的设计具有重要意义.目前所概括出的矿化机制有:NCP诱导的外延成核理论、聚合物诱导的液体前驱体理论、尺寸排阻理论、静电吸引理论、吉布斯塘南平衡理论.

3.1 NCP诱导的外延成核理论

NCPs是存在于矿化组织细胞外基质中的一种非胶原蛋白,如骨钙素、骨桥蛋白、牙本质基质蛋白等,在矿化基质中对晶体成核和生长过程起着促进或抑制的作用.最初,Hoang等[50]只对天然骨钙素与晶体的作用进行了研究,发现骨钙素可以通过其三维构象与特定晶体间的外延调节溶液中晶体的生长;然而,这些外延关系是基于有序HAP晶格的结构建模计算的,而并非基于骨中结晶不良的碳酸磷灰石.因此,NCP诱导的外延成核形成矿化胶原纤维的假说尚未完整.

天然或重组NCPs直接用于仿生领域中在经济方面不太现实且存在易降解、纯度不高等弊端.因此,研究者根据质子化NCPs带负电的特征寻找了成分单一、合成简单、价格便宜的NCPs类似物——聚阴离子并对其稳定或者诱导前驱体的作用进行了探索,在胶原矿化过程做出了不少贡献.同时,提出了持不同观点的矿化机制.

3.2 聚合物诱导的液体前驱体机制(PILP)

Olszta等[51]利用扫描电镜对矿化胶原进行观察,根据矿物相浸润胶原的程度判断矿化过程,提出了聚合物诱导的液体前驱体机制(PILP).胶原矿化过程是通过液相非晶态前驱体溶液渗入纤维内部再结晶,即在矿化液中钙离子和聚合物发生结合用以隔离钙离子和碳酸根离子、抑制成核,形成中间液相核前簇,再转变为固体非晶态物质最后转化成结晶碳酸钙,实现一个多步结晶过程.

基于最初的实验结果只是成功地证明了矿物前驱体可以浸润胶原纤维并且也只针对碳酸钙矿物,而磷酸钙才是骨自身的矿物质;此外,对于前驱体溶液进入胶原纤维的机制还暂不明确.因此,为进一步阐明骨形成过程中胶原如何实现纤维内矿化,Olszta等[52]研究了PAsp稳定的ACP在矿化胶原纤维过程中的矿物渗透机理、非晶态向晶体的转变、纤维内晶体排列机理等,认为矿化分为三个过程:(1)带负电荷的聚合物抑制成核,同时在结晶溶液中液相前驱体与周围的水分产生液液相分离,形成高度水合的非晶态磷酸钙相的纳米液滴;此纳米液滴吸附在胶原纤维上,并由于其流体特性通过毛细管作用进入胶原纤维的孔区和间隙(如图7(a)所示);(2)胶原纤维被无定形的矿物前驱体浸润的同时失去结合水(如图7(b)所示); (3)非晶态前体逐步转变为固体非晶相最后结晶形成HAP纳米晶体嵌入胶原纤维内(如图7(c)所示).上述“毛细管渗透机制”的提出对“PILP理论”进行了充分补充.

图7 PILP矿化机制示意图[52]

这一假说很好地解释了生物矿化过程中存在无定形中间相的事实,逐渐替代了“NCP诱导的外延成核理论”,被广泛用于解释各种仿生矿化和生物矿化现象.

3.3 尺寸排阻理论

胶原纤维具有半透膜性质,可以选择性地排阻大于40 kDa的分子.虽然被排除在纤维外,但它们可以通过部分扩散到原纤维中的小磷灰石晶体核来启动矿化或者通过抑制除原纤维内以外的任何地方的磷灰石生长来触发原纤维内矿化.胎儿蛋白是一种分子量为48 kDa的大分子血清蛋白,也是天然骨中含量最丰富的NCPs之一,但其分子量较大被胶原纤维排除在外.最初,Toroian等[53]探究了胎儿蛋白诱导胶原矿化的作用,发现在胶原纤维外部磷灰石形成过程中,部分可能产生小的晶体核,这些高达12个单位细胞大小的磷灰石晶体随后扩散到原纤维内并生长成较大的磷灰石晶体,而存在于纤维外的胎儿蛋白可能与残留在纤维外溶液中的晶体结合,从而确保只有纤维内的晶体生长.提出胶原纤维矿化有可能依赖于排除在纤维外的分子量较大的胎儿蛋白.

后续实验中,为了进一步了解胎儿蛋白诱导胶原矿化所发生的机制,Price等[54]再次将胎儿蛋白引入到胶原纤维矿化中,发现在高浓度的磷酸钙溶液中,晶体的形成由均匀成核驱动,未加入胎儿蛋白的胶原纤维发生了纤维外的矿化;而加入胎儿蛋白之后,胶原纤维外矿物的生长和沉淀被抑制,而胶原内部的矿化不能被抑制,从而使得纤维内矿化效果更好.该过程也称为“通过抑制剂排除进行矿化”,即排除在纤维外的分子抑制纤维外磷灰石的生长从而触发胶原纤维内的矿化.

这一理论强调了胶原结构的半透性对纤维内矿化形成的重要作用,为血清诱导的胶原钙化提供了一个合理的机制.然而,这一理论未提及无定形中间相的存在,不能解释小磷灰石晶体存在的必要性以及小晶体渗入纤维内空间的驱动力.

3.4 静电吸引理论

上述三种理论从不同角度解释了NCPs在胶原矿化中的重要作用,其中胶原被认为是矿物形成的被动支架和模板.但在矿化研究过程中,胶原被证实与磷酸钙的成核之间存在密切关系[55],亦可作为矿化的催化剂.这一作用主要归因于胶原纤维上的带电氨基酸残基,通过电荷相互作用吸引矿物,诱导矿物渗透到胶原纤维内.

Landis等[9,56,57]认为胶原所带有的正电荷与负电荷可分别与矿化液中的磷酸盐离子和钙离子发生相互作用,随后富集的离子在孔区附近成核形成HAP晶体.此理论存在的致命缺陷在于未体现NCPs及其类似物的作用,而事实上实现纤维内矿化的条件之一是NCPs及其类似物所起到的稳定诱导作用,与事实背离导致上述观点未得到普遍认可.

Nudelman等[55,58,59]亦赞同胶原与前驱体之间的相互作用对矿化具有非常重要的意义.但与上述理论不同之处在于:该研究者们将胶原纤维的周期性区域划分为了abcde 5类条带,其中a和c带呈正电性,可静电吸引前驱体溶液中负电性物质进入胶原纤维内实现矿化.例如,PAsp稳定的ACP前驱体溶液会特定地进入胶原纤维孔区中C端a带形成矿化(如图8所示).主要原因在于胶原纤维孔区中C端a带呈正电的氨基酸簇与带负电荷的PAsp-ACP矿物复合物发生了相互吸引作用,在诱导ACP进入纤维过程中起着关键作用,从而实现胶原纤维内的矿化[56].此理论较好地解释了矿化发生位点具有特异性的事实,且与NCPs及其衍生物带负电荷的特性相符合.然而,却无法解释为什么同样呈正电性的c带未发生明显的矿化现象.

图8 醋酸铀染色非矿化与矿化24 h胶原纤维的TEM图[58]

在2020年,Wang等[60]制备了一种新型诱导剂——两性寡肽并研究了胶原的矿化过程.虽然其结果支持了静电吸引理论,但同时提出了新的矿化过程(如图9所示):(1)寡肽自组装成丝状结构并通过静电与氢键作用结合在胶原纤维表面; (2)寡肽中带有负电的Glu等氨基酸残基因在静电作用下自发吸引矿化液中的Ca2+,磷酸钙前驱体形成不同形状的无定形前体; (3)无定形前体在纤维内形成平行于纤维长轴排列的HAP晶体,实现胶原纤维内矿化.该理论进一步扩充了静电吸引理论的内涵.

图9 两性寡肽诱导矿化的机制示意图[60]

3.5 吉布斯塘南(Gibbs-Donnan)平衡理论

前期研究中,为了模拟天然骨的仿生过程,一般选用带羧基的聚阴离子物质作为诱导剂,认为带负电的NCPs类似物可以稳定钙磷溶液,并与胶原相结合诱导矿化.但在后续研究中发现阳离子NCPs类似物也可以稳定钙磷溶液并诱导矿化.Niu等[61]使用两种诱导剂(PAH与PAsp)分别在胶原表面引入正、负电荷,使其在具有正电性的PAH-ACP前体中矿化,发现引入正电荷的胶原矿化效果更好,排除了胶原与聚电解质稳定的液体前驱体间只存在短程静电相互作用的观点.基于此,作者提出了基于电荷和渗透压双平衡的Gibbs-Donnan平衡理论.胶原纤维自身具有半透膜性质,矿化过程中PAH因分子量过大而被排斥在纤维外,但由于其本身的阳离子特性会吸引纤维外的负离子而排斥正离子;为维持纤维内外的电荷平衡,矿化液中的正离子分布发生改变.阳离子如Ca2+、Na+移出纤维;为满足电势平衡,Cl-等阴离子亦会移出纤维.纤维外界离子浓度过大,渗透压使得纤维内部的水分流出、胶原收缩,液态矿化前体被吸引进入胶原内部,并在胶原内部形成弹性回缩力,在氨基酸残基的作用下从无定形转化为结晶态的磷灰石,实现纤维内矿化.

Gibbs-Donnan平衡的建立表明了胶原纤维的矿化是由电荷分布驱动的静电力以及纤维内外腔室间渗透压驱动的远程渗透共同的作用,首次揭示了渗透力在胶原矿化中的关键作用,为ACP浸润胶原纤维的驱动力提供了重要的见解.此外,这一新理论提示了在骨组织生物矿化的研究中不应该局限于酸性NCPs,大量的碱性蛋白甚至是广泛存在的蛋白聚糖都有可能影响着生物矿化的进程.但在这些研究中只使用了部分体外模型和分子模拟,还未有直接的实验来支持这些理论.

综上所述,胶原纤维的矿化机制与胶原纤维结构、诱导剂的结构与性质密切相关.PILP理论清楚地总结了胶原的矿化过程,并解释了聚阴离子诱导剂对矿化液的抑制作用以及诱导剂-矿化液无定形中间相存在的事实,是目前最普遍使用的一种矿化理论.尺寸排阻理论的提出是基于分子量较大的诱导剂无法进入胶原纤维内部但可促使纤维内矿化的事实,但此理论不涉及无定形中间相且无法对小晶体进入纤维内空间的动力进行解释,存在一定争议性.静电吸引理论完善了胶原、聚阴离子以及矿化前驱体之间的作用,解释了矿化发生位点具有特异性的事实.吉布斯塘南平衡理论综合考虑了胶原的半透膜性及两性、诱导剂的分子量以及带电情况,是目前考虑因素较为全面的理论;该理论引入电荷和渗透压双平衡作用的理念,综合解释了多种因素在胶原矿化过程中的作用,但目前为止仍需要大量的实验来进行验证.

虽然以上机制理论均具有一定的代表性,但存在争议或论证不足等问题.迄今为止,仍未有理论能够从胶原纤维、矿化液和诱导剂之间的相互作用等方面完美诠释胶原矿化机制.因此胶原的矿化机制仍需不断完善、更新.

4 结论与展望

天然骨是自然界中的有机-无机纳米复合材料,矿化胶原纤维很大程度上赋予了其优良的力学性能和良好的生物相容性.为了更好地了解胶原生物矿化,并为矿化胶原基材料的设计提供见解,本文综述了目前矿化胶原材料的制备和胶原矿化机制及调控因素.

在矿化胶原材料的制备中,除了自体骨本身的羟基磷灰石矿物外,不断实现矿物的多元化以赋予其更多优良的性能.除此之外,若将矿化胶原与生物活性物质复合,可有效增强其骨诱导性能,例如天然骨材料、人工骨材料、细胞及血浆、生物因子及药物、多种生物活性物质等.但如何提高其成骨诱导活性,修复大面积复杂骨缺损,同时使其降解速率与成骨速度更加协调平衡需要进一步明确.目前来看,胶原纤维的矿化机制存在很多种可能性,对现有的机制进行补充完善或者提出新的矿化机制是未来发展的趋势.