儿童原发免疫性血小板减少症IL-37、VEGFA、TGF-β1的表达及其与T细胞的相关性研究

童琳琳 王立华 方芳 许彬 郑素华

（1.河北省邯郸市中心医院小儿内科，河北邯郸 056001；2.河北省邯郸市传染病医院影像科，河北邯郸 056001）

原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia, ITP）是一种临床较为常见的免疫获得性出血性疾病，可导致患者内脏、皮肤及黏膜出血，严重时会对患者的生命安全造成威胁［1］。研究结果表明，ITP在儿童出血性疾病的病因中占比高达70%，而临床上部分ITP患儿会随疾病的进展演变为慢性ITP，需借助免疫抑制剂进行长期治疗，预后较差，对患儿的身心健康造成严重影响［2-3］。因此，积极探讨与儿童ITP 发生相关的细胞因子具有重要意义。 白细胞介素-37（interleukin-37, IL-37）是自身免疫性疾病中炎症反应及先天免疫的天然抑制剂，但其是否参与ITP疾病的发生目前尚不明确［4］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）A 可通过影响病理性血管新生、介导内皮细胞增殖与转移、增加血管通透性等诸多途径，对血管生成依赖性疾病进行相应调控［5］。 转化生长因子（transforming growth factor, TGF）-β1 是人体内发现最多的TGF-β，在机体免疫调节中发挥着重要作用［6］。研究表明，机体免疫因子相关T细胞比例异常失衡，如调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）/辅助性T 细胞17（helper T cell 17, Th17），是造成ITP 发生的重要因素［7］。然而，目前尚无有关ITP患儿IL-37、VEGFA、TGF-β1 的表达情况及其与T细胞的相关性研究报道。基于此，本研究对45 例ITP 患儿治疗前后的IL-37、VEGFA、TGF-β1 水平与Treg、Th17及Treg/Th17水平进行测定，探讨IL-37、VEGFA、TGF-β1 水平对ITP 患儿发病与治疗的影响，并分析相关机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取河北省邯郸市中心医院2020 年1 月—2022 年4 月收治的45 例ITP 患儿为ITP 组。纳入标准：（1）符合儿童ITP的相关诊断标准［8］；（2）年龄1～13 岁；（3）初次起病；（4）患儿监护人知情并签署知情同意书。排除标准：（1）临床资料不完整者；（2）既往有血液疾病史者；（3）合并严重肝、肾等重要脏器功能不全者；（4）合并恶性肿瘤者；（5）合并严重精神疾病，无法配合研究进行者；（6）合并严重自身免疫疾病者；（7）继发性血小板减少症者。另选取同期健康体检儿童30 例作为健康对照组。两组儿童的年龄、体重指数、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05），ITP组患儿血小板计数低于健康对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 治疗方法与样本采集

考虑丙种球蛋白等药物可能出现的不良反应、样本同质性等因素，研究用药均采用泼尼松进行［9］。ITP组患儿均给予泼尼松片（天津天药药业股份有限公司， 规格： 10 mg， 国药准字H20203398）口服，1.0～1.5 mg/kg，3 次/d，至血小板计数稳定大于100×109/L 1～2 周后，逐步减停。根据实际临床治疗情况合并使用止血、抗感染等对症治疗。

采集健康对照组儿童（体检时）和ITP组患儿治疗前、泼尼松停药后肘静脉血4 mL，肝素钠抗凝。

1.3 IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA检测

应用TRIzol 法（相关试剂购自美国Invitrogen公司）提取外周血中总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成，然后按照实时荧光定量PCR 试剂盒说明书进行各目的基因的实时荧光定量，试剂盒均购自大连TaKaRa 公司。最后应用荧光定量PCR仪（美国ABI公司）对IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA 进行测定，并应用2-△C法计算出IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平。

1.4 Treg与Th17检测

选取肝素钠抗凝血100 μL，加入2.5 μL Foxp3-APC、20 μL CD25-FITC 与20 μL CD4-FITC 单克隆抗体（单抗）并混合均匀，加入2 mL 红细胞裂解液并混合均匀，1 500 r/min 离心5 min 后弃除上层清液，加500 μL PBS 重悬细胞，应用流式细胞仪对Treg 含量进行最终测定。另取100 μL 肝素钠抗凝血用RPMI 1640培养液进行等体积稀释，再加入刺激剂2 μL，放置在37℃水育箱中恒温孵育5 h；将20 μL CD3-PC 与20 μL CD8-FITC 单抗混合均匀后加入，加入2 mL 红细胞裂解液混合均匀，离心机高速离心，10 000 r/min，5 min后弃除上层清液；加入250 μL 破膜剂固定，依次进行孵育、洗涤及离心，再次弃除上层清液并加入100 μL 洗涤缓冲液，加20 μ LIL-17A-PE单抗混合均匀，再次洗涤，高速离心5 min后再次弃除上层清液并加入500 μL PBS 重悬细胞，应用流式细胞仪对Th17 含量进行最终测定。Foxp3-APC、CD25-FITC、CD4-FITC、CD3-PC、CD8-FITC 与IL-17A-PE 单抗，相关重悬细胞及流式细胞仪等均购自美国Becton Dickinson公司。

1.5 统计学分析

选用SPSS 24.0 建立数据库并进行数据分析处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用两样本t检验。计数资料以例和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson检验，r代表相关系数，值越大代表相关性越强。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 两组IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平

ITP 组患儿治疗前后IL-37 mRNA 水平高于健康对照组（P＜0.001），VEGFA 及TGF-β1 mRNA 水平低于健康对照组（P＜0.001）。ITP 组患儿治疗后IL-37 mRNA 水平低于治疗前（P＜0.001），VEGFA及TGF-β1 mRNA 水平高于治疗前（P＜0.001）。见表2。

表2 两组IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平比较 （± s）

表2 两组IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平比较 （± s）

注：［ITP］原发免疫性血小板减少症；［IL-37］白细胞介素-37；［VEGFA］血管内皮生长因子A；［TGF-β1］转化生长因子-β1。

组别例数IL-37 mRNA VEGFA mRNA TGF-β1 mRNA t值P值t值P值t值P值治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后ITP组t值P值34.435＜0.001 11.551＜0.001 31.253＜0.001 12.893＜0.001 45.071＜0.001 22.047＜0.001健康对照组45 27.408 30 1.04±0.08 2.07±0.15 26.889＜0.001＜0.001 27.000＜0.001-1.31±0.11 2.89±0.31 1.27±0.13-2.16±0.18 2.47±0.21 0.95±0.07-1.58±images/BZ_44_923_2798_926_2798.png0.14

2.2 治疗前后Treg、Th17及Treg/Th17水平比较

ITP组患儿治疗前后Th17水平高于健康对照组（P＜0.001），Treg、Treg/Th17 水平低于健康对照组（P＜0.001）。ITP 组患儿治疗后Th17 水平低于治疗前（P＜0.001），Treg、Treg/Th17 水平高于治疗前（P＜0.001）。见表3。

表3 治疗前后Treg、Th17及 Treg/Th17水平比较 （± s）

表3 治疗前后Treg、Th17及 Treg/Th17水平比较 （± s）

注：［ITP］原发免疫性血小板减少症；［Treg］调节性T细胞；［Th17］辅助性T细胞17。

组别例数Treg (%)Th17 (%)Treg/Th17治疗前治疗后t值P值t值P值治疗前治疗后t值P值治疗前治疗后健康对照组ITP组t值P值14.131＜0.001 5.720＜0.001 16.989＜0.001 6.513＜0.001 28.140＜0.001 14.909＜0.001 30 45 7.6±2.2 2.9±0.5-5.3±1.4 0.6±0.1 2.3±0.5-1.1±0.4 11.314＜0.001 12.446＜0.001 13.414＜0.001 13.5±2.8 1.3±0.4-5.3±1.9

2.3 IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA 水平与Treg、Th17、Treg/Th17的相关性

健康对照组中IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平与Treg、Th17、Treg/Th17 无相关（P＞0.05）。ITP组患儿治疗前后IL-37 mRNA水平与Treg、Treg/Th17呈显著负相关（P＜0.05），与Th17呈显著正相关（P＜0.05）；ITP组患儿治疗前后VEGFA、TGF-β 1 mRNA 水平与Treg 及Treg/Th17 均呈显著正相关（P＜0.05），与Th17 呈显著负相关（P＜0.05）。见表4～5。

表4 健康对照组IL-37、VEGFA、TGF-β1 mRNA水平与Treg、Th17及Treg/Th17的相关性分析

3 讨论

儿童ITP是以自发性出血及血小板数量减少等为主要特征的儿科常见出血性疾病，病毒感染是其最主要的致病因素，目前临床治疗以大剂量糖皮质激素治疗方案较为多用，疗效显著，一般预后良好［10-12］。但研究指出，20%～25%的ITP 患儿会进展为慢性ITP，存在一定的出血风险，从而对患儿的生命安全构成威胁［13-14］。研究表明，免疫因素与ITP 的发病机制有关，且国内有研究表明，Treg 与Th17 及其分泌的细胞因子在机体内表达异常可能在ITP发生发展中发挥重要作用［15］。而目前对于ITP患儿细胞因子水平的发病机制暂无明确定论，仍需大量临床研究加以探索，以期为日后临床诊治该疾病提供宝贵的指导性依据。

本研究中ITP 组患儿治疗前后IL-37 mRNA 及Th17 水平均明显高于健康对照组，VEGFA、TGFβ1 mRNA 及Treg、Treg/Th17 水平均明显低于健康对照组；且与治疗前比较，治疗后ITP 组患儿IL-37 mRNA及Th17水平明显下降，VEGFA、TGF-β1 mRNA 及Treg、Treg/Th17 水平明显上升，提示IL-37表达在ITP患儿中异常升高，而VEGFA、TGF-β 1 表达在ITP 患儿中异常降低，IL-37、VEGFA 及TGF-β1可能通过对Treg、Th17及Treg/Th17进行调控，进而参与儿童ITP 的发生发展。IL-37 是一种常见的抗炎细胞因子。陈珍等［16］研究结果表明，IL-37 在ITP 患者中异常表达，可能通过调节机体的炎症及免疫反应来参与疾病的发生与发展。Osborne 等［17］研究显示，IL-37 高表达可抑制T 细胞活化与增殖。Geindreau 等［18］指出，VEGF 可通过直接相互作用和间接调节内皮细胞上的蛋白质表达或血管通透性，进而参与先天性和适应性免疫反应的调控。VEGFA 是VEGF 家族中重要成员，在慢性ITP 患儿T 细胞样本中表达水平明显下降，有较大的可能性成为ITP诊断及预后评估的生物标志物［19］。TGF-β1对免疫细胞的发育和成熟、维持免疫耐受和体内平衡及调节免疫反应的各个方面都至关重要［20-21］。动物实验研究结果表明，TGF-β 1通过与抗血小板抗体结合，可以促进反应性T 细胞的增殖与活化，引起Treg 免疫抑制功能降低，造成免疫平衡异常紊乱，使血小板遭受更加严重的破坏［22］。

本研究相关性分析结果显示，ITP组患儿治疗前后IL-37 mRNA 水平与Treg、Treg/Th17 均呈显著负相关，均与Th17呈显著正相关；ITP组患儿治疗前后VEGFA、TGF-β1 mRNA 水平与Treg、Treg/Th17 均呈显著正相关，均与Th17 呈显著负相关。进一步证实IL-37、VEGFA 及TGF-β1 的表达水平与Treg、Th17、Treg/Th17 存在明显关联，这可能是造成ITP 患儿体内Treg/Th17 比例失衡的重要因素，IL-37、VEGFA及TGF-β1均是临床治疗ITP患儿的潜在靶点。由于本研究属单中心队列研究，存在样本量少、样本区域代表性强等特点，故仍需通过多中心大样本量研究对本研究结论作进一步佐证。

综上所述，IL-37、VEGFA、TGF-β1 在儿童ITP中存在异常表达，且与Treg/Th17比例失衡有明显关系，推测IL-37、VEGFA、TGF-β1等细胞因子可能参与ITP 的发生发展，或可成为治疗儿童ITP的重要潜在靶点。

利益冲突声明：所有作者声明无利益冲突。