恒温扩增芯片法对下呼吸道病原体联合检测的临床应用

成彬 田刚 刘艳枚 陈晨 周鹏 周美芳 罗瑛 尹卫国★

下呼吸道感染（lower respiratory tract infection，LRTI）是全球因传染病导致死亡的主要原因之一，在世界十大死亡病因中排名第四，在发展水平较低的国家中，下呼吸道感染疾病的在死亡原因中更是靠前，在我国也是最常见的疾病之一［1］，发病率和死亡率都很高，主要由细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体甚至寄生虫等引起，包括气管、支气管、细支气管和肺组织等炎症［2］。随着抗生素的广泛应用，LRTI 的病原菌谱不断变化，增加了临床诊断和治疗的难度。因此，快速、准确地找到真正感染的病原体是临床亟待解决的问题。传统的鉴定方法主要是病原菌的分离、培养［3］、免疫学方法。然而，这些方法操作繁琐且耗时长，诊断的敏感性和特异性相对较低。常用的分子生物学技术有核酸杂交技术、PCR 技术、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、测序技术等等。近年来，有大量文章报道，恒温扩增芯片法（isothermal amplification chip，IAMP）联合应用了LAMP，微流控芯片和荧光数字信号处理技术，能够同时检测出13 种病原体，特异性强、敏感性高，因检测操作简单、快速准确，对技术水平要求相对较低，所需实验器材简单，已被广泛应用于感染性疾病的诊断中［4］。本研究通过对本院9 078 例疑似下呼吸道感染患者进行13 种下呼吸道病原体检测，并通过统计分析检测结果，为LAMP 联合芯片技术应用于临床早期诊治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2019 年1 月至2022 年7 月于清远市人民医院门诊及住院部就诊的患者标本9 078 例。其中男性6 478 例，女性2 600 例，年龄范围为0～104 岁，中位年龄（62.47±17.09）岁。按年龄分为3 组：＜18岁组222 例，18～59 岁组3 265 例，＞59 岁组5 591例。按就诊时间分为春季（3 月～5 月）2 659 例，夏季（6 月～8 月）2 545 例，秋季（9 月～11 月）1 533 例，冬季（12 月～2 月）2 341 例。纳入标准：①门诊及住院就诊疑似下呼吸道感染的患者；②有发热咳嗽等呼吸道感染症状或胸部提示有下呼吸道感染体征；③标本类型为痰液或肺泡灌洗液；排除标准：①临床资料不完整；②检测结果不完整；③标本类型非痰液或肺泡灌洗液。9 078 例患者主要来自危重医学病科5 828 例（64.20%），其次为呼吸科2 161 例（23.80%），脑科513 例（5.65%），儿科129 例（1.42%），其他临床科室447 例（4.92%），＞59岁成年人多见，为5 591 例（61.59%）。本研究内容已经通过院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本要求

采集患者的痰液或肺泡灌洗液标本，样本量不少于0.6 mL，置于无菌容器内，密封送检。

1.2.2 仪器与试剂

恒温扩增仪和配套试剂均来自北京博奥晶典生物技术有限公司，包括呼吸道病原菌核酸检测试剂盒、细菌基因组DNA 提取试剂盒和RTisochipTM-W 微流控恒温扩增核酸分析仪等。液化标本的10%NaOH 溶液为实验室自配。

1.2.3 标本检测

按照说明书步骤进行测定。结果判定使用相应软件进行分析。本试剂盒的每个芯片的每个反应池都包埋固定一套引物，用于一种核酸靶序列的扩增与检测，可一步完成对13 种常见下呼吸道病原菌的检测，包括肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae.Mpn），肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，Cpn），肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia，Spn），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Sau），大肠埃希氏菌（Escherichia coli，Eco），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn），铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pae），鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Aba），嗜麦芽窄食单胞菌（Streptomonas maltophilia，Sma），耐甲氧西林葡萄球菌（Methicillinresistant Staphylococcus，MecA），结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，Mtb），流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，Hin），嗜肺军团菌（Legionella pneumonia，Lpn）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。采用Excel 处理数据。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下呼吸道病原体检出情况

患者下呼吸道病原体总检出率为62.18%（5 645/9 078），检出的主要病原体为Aba 30.39%（2 759/9 078），Kpn 24.59%（2 232/9 078），Pae 16.19%（1 470/9 078）。见图1。其中，单一感染占29.39%（2 668/9 078）。多重感染占32.79%（2 977/9 078），其中二重感染为主，三重及以上感染较少见。见表1。

2.2 不同性别病原体检出情况

男性患者检出至少一种病原体阳性4 166 例，阳性率为64.1%（4 166/6 478）；女性患者检出至少一种病原体阳性1 479 例，阳性率为56.88%（1 479/2 600）。男性患者阳性率高于女性患者，差异有统计学意义（χ2=43.501，P＜0.001），其中男性患者的Kpn，Pae，Aba，Sma 的感染阳性率均高于女性患者，女性患者的Cpn 的感染阳性率高于男性患者，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 不同性别下呼吸道感染病原体阳性率比较［n（%）］Table 2 Comparison of pathogen positive rate of lower respiratory tract infection with different genders［n（%）］

2.3 三组病原体检出情况

三组患者感染阳性率分别为72.97%（162/222），55.22%（1 803/3 265），65.82%（3 680/5 591），差异有统计学意义（χ2=109.718，P＜0.001）。＞59 岁组的Aba、Eco、Pae 和Sma 的阳性率均高于＜18 岁组和18～59 岁组，Spn、Cpn 以及Hin 的感染阳性率＜18 岁组均高于18～59 岁组及＞59 岁组，18～59 岁组的Mtb 感染阳性率高于＜18 岁组和＞59 岁组，差异有统计学意义（P＜0.05）。三组间Kpn、Mpn、Lpn 和MecA 的阳性率差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各年龄组下呼吸道感染病原体阳性率比较［n（%）］Table 3 Comparison of pathogen positive rate of lower respiratory tract infection in different age groups［n（%）］

2.4 不同年份病原体检出情况

2019 年到2022 年患者总检出阳性率分别为67.28%（1 536/2 283），67.49%（1 586/2 350），56.11%（1 465/2 611），57.69%（1 058/1 834），2019年和2020 年的患者阳性率高于2021 和2022 年，差异有统计学意义（χ2=110.084，P＜0.001）。近4年各病原体阳性率比较，Cpn 和Hin 的感染阳性率在2019 年明显高于其余3 年，2020 年的Eco、Mtb、Sau 的阳性率高于2021 年和2022 年，2019年和2020 年的MecA、Sma 以及Pae 的阳性率高于2021 年和2022 年，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.5 不同季节病原体检出情况

四个季节检出病原体阳性率分别为60.10%（1 598/2 659）、62.71%（1 596/2 545）、62.43%（957/1 533）、63.82%（1 494/2 341），春季阳性率低于其它三个季节，差异有统计学意义（χ2=7.921，P=0.048）。Aba 和Sau 在冬季的感染率较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 不同季节下呼吸道病原体感染阳性率比较［n（%）］Table 5 Comparison of positive rate of pathogen infection in lower respiratory tract in different seasons［n（%）］

3 讨论

下呼吸道感染是一个重大的公共卫生问题，也是全球所有年龄层疾病和死亡的主要原因，其引起原因具有多样性，给临床诊疗带来了巨大的挑战。当缺乏病原体信息时，医生经常根据经验使用广谱抗生素，导致耐药率不断增加［5］。传统分离培养技术仍然是病原学检测的“金标准”，但其灵敏度低，耗时长，误诊率较高［2，6］，难以满足临床的需求。近年来，分子生物学方法成为了呼吸道病原体检测的一个新方向。IAMP 法对送检条件要求没有那么高，能够很大程度上提高阳性检出率，可用于辅助诊断或鉴定临床上比较常见的LRTI，同时也可用于流行病学研究［7］。

本研究检测的9 078 例疑似下呼吸道感染的患者标本，主要为Aba、Kpn 和Pae 感染，与毛成晔等［8］的研究结果相一致。2019 年Cpn 和Hin 的感染阳性率明显高于其余3 年，可能是因为这两种病原体主要通过空气中的飞沫传播，新冠疫情爆发后，人们习惯于佩戴口罩，降低了传播的可能性。随着新冠疫情的防控力度加大，大部分病原体阳性率在后两年都有所下降，近4 年各病原体阳性率总体分布趋势大体一致。

从性别分布来看，本研究结果显示，男性患者阳性率高于女性患者，其中男性患者的Kpn，Pae，Aba，Sma 的感染阳性率均高于女性患者。这可能与社会分工及生活习惯有关，男性患者较女性患者更多也增加了其医院感染的可能性。

从年龄分布来看，＜18 岁组的呼吸道病原体感染阳性率最高，18～59 岁组的阳性率最低。可能是因为＜18 岁组标本中主要以幼儿为主，身体机能和免疫系统发育不完善，＞59 岁组身体机能下降和各种基础疾病的累积。感染的病人多是老年患者、危重疾病及机体抵抗力弱的患者。＜18 岁组的Spn、Cpn 及Hin 的感染阳性率高于另外两组，这与段肖丽等［9］的研究结果相一致。

从季节分布来看，春季总体阳性率低于其它三个季节，其它各季差异不大。有文献报道，下呼吸道病原体感染与季节分布有一定关联［9］，但本研究并未发现明显联系，可能与不同地方气候环境等因素有关。

综上所述，本研究汇总了近四年来清远地区疑似下呼吸道感染患者的病原学检测结果，分析了十三种下呼吸道病原体的分布特征，有利于下呼吸道感染的临床诊断、治疗及合理用药。