蚯蚓液对13～43周龄蛋鸡产蛋性能、蛋品质、血清生化指标和肠道健康的影响

刘珍妮 谢华亮 连 海 谭东海 成 笛 孔智伟 张 强 钟云平 雷小文

(赣南科学院,赣州市畜牧水产研究所,赣州 341401)

随着蛋鸡养殖业的不断发展,蛋鸡的健康问题越来越受到关注,蛋鸡机体健康状态良好可以保证生产性能和蛋品质。在蛋鸡饲粮中添加天然无公害的饲料添加物也成为了当下热门研究。蚯蚓液为蚯蚓自身水解酶分解蚯蚓蛋白质所获得的产物,除18种氨基酸和少量短肽外,还包括有多种生物酶、抗菌肽等活性物质[1]。朱才箭等[2]研究发现,饲粮添加2%蚯蚓液能改善樱桃谷鸭的肉品质。金恒等[3]研究表明,饲粮添加1%、1.5%、2%蚯蚓液对樱桃谷鸭的生长性能均没有显著影响。雷小文等[4]研究发现,蚯蚓液不仅能够提高宁都黄鸡的生长性能,降低饲养成本,还能改善肌肉品质,且不影响宁都黄鸡的产肉性能和正常生理机能。本课题组前期研究了饲粮中添加不同水平蚯蚓液对番鸭的影响,结果显示,虽然饲粮添加1.5%蚯蚓液不能提高番鸭的生长性能,但是添加2.5%蚯蚓液使番鸭的日增重提高了5.93%,70日龄体重升高了5.83%,料重比降低了0.88%[5];同时,添加2.5%蚯蚓液还能够改善番鸭肉质[6]。此外,本课题组前期研究还发现,饲粮添加2.5%蚯蚓液在促进总抗氧化力与超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶活性提高与免疫球蛋白M、免疫球蛋白G含量增加的同时,还能抑制丙二醛、白细胞介素-2、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-17的表达,具有提高番鸭抗氧化性能以及免疫功能的作用[7]。与此同时,蚯蚓液对番鸭V4区肠道菌群的多样性有显著的改善作用[8]。本课题组前期将蚯蚓液应用于育成期和初产期蛋鸡的饲养,结果发现蚯蚓液可以促进蛋鸡尿酸排泄,增强抗氧化能力和免疫能力[9]。为进一步探究长期使用蚯蚓液对蛋鸡的影响,本试验以13～43周龄蛋鸡为试验对象,探究饲粮中添加蚯蚓液对蛋鸡产蛋性能、血清生化指标、肠黏膜形态和肠道微生物多样性的影响,以期为蚯蚓液在蛋鸡无抗养殖中的合理应用提供理论和科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点

饲养试验于2021年6月至2022年2月在江西省赣州市龙南宏昌蛋鸡养殖有限公司养殖基地开展完成,其余试验于2022年2—6月在赣州市畜牧水产研究所完成。

1.2 蚯蚓液的制备

试验所用蚯蚓选用经牛粪养殖的健壮赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida,购于定南县东山嘉禾现代农业有限公司),并根据课题组建立的方法[1]制备蚯蚓液。根据国家标准《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》(GB/T 6432—2018)、《饲料中粗脂肪的测定》(GB/T 6433—2006)、《饲料中总磷的测定 分光光度法》(GB/T 6437—2018)、《饲料中粗灰分的测定》(GB/T 6438—2007)、《饲料中硒的测定》(GB/T 13883—2008)、《饲料中总砷的测定》(GB/T 13079—2006)、《饲料中汞的测定》(GB/T 13081—2006)、《饲料中铬的测定》(GB/T 13088—2006)、《饲料中镉的测定方法》(GB/T 13082—1991)、《饲料中铅的测定 原子吸收光谱法》(GB/T 13080—2018)和《饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定 原子吸收光谱法》(GB/T 13885—2017)、《饲料中氨基酸的测定》(GB/T 18246—2019)和《饲料中色氨酸的测定》(GB/T 15400—2018)对蚯蚓液中常规营养成分、微量元素、氨基酸和重金属的含量进行测定。采用分光光度法测定蚯蚓液中蛋白酶(PG)、纤维素酶(CL)、脂肪酶(LPS)和过氧化物酶(POD)的活性。采用尿激酶琼脂糖-纤维蛋白平板法测定蚯蚓液中蚓激酶(EFE)的活性。蚯蚓液中常规营养成分、微量元素、氨基酸和重金属含量以相关酶活性见表1。

表1 蚯蚓液中常规营养成分、微量元素、氨基酸和重金属含量以及相关酶活性 Table 1 Contents of routine nutrients, trace elements, amino acids, heavy metals and activities of related enzymes in earthworm hydrolysate

表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) %

1.3 试验设计

选取432只13周龄、体重接近、生长发育良好的海兰粉蛋鸡,随机分成4组,每组6个重复,每个重复18只。4组蛋鸡分别饲喂添加0(对照组)、1%(1%蚯蚓液组)、2%(2%蚯蚓液组)和3%蚯蚓液(3%蚯蚓液组)的试验饲粮。试验期为30周。试验饲粮组成及营养水平见表1。因为饲料原料具有吸水性,且本研究中的蚯蚓液添加水平较低,为使饲料原料与蚯蚓液混合均匀,采用逐级预混的方式进行添加。试验饲粮中粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、蛋氨酸、赖氨酸、钙和磷含量测定方法同1.2中所述方法。根据国家标准《饲料中粗纤维的含量测定 过滤法》(GB/T 6434—2006)测定饲粮中粗纤维含量。根据国家标准《畜禽饲料有效性与安全性评价 强饲法测定鸡饲料表观代谢能技术规程》(GB/T 26437—2010)对饲粮的代谢能进行测定。

1.4 检测指标

试验结束时,每个重复随机抽取43周龄蛋鸡的6枚鸡蛋用于蛋品质测定。此外,每个重复随机取6只禁食12 h的43周龄蛋鸡,采集翅静脉血液5 mL于促凝管内,静置10 min,取上清液于离心管中,2 500 r/min离心10 min,分离血清用于后续试验;每组随机采集3只43周龄蛋鸡的十二指肠,置于预先含有4%多聚甲醛的玻璃瓶内进行固定,并采集盲肠内容物于灭菌冻存管中,迅速置于液氮中保存,待测。

1.4.1 产蛋性能和蛋品质测定

饲养试验期间,以重复为单位记录每天的产蛋总数、蛋重和采食量。试验结束后,以重复为单位计算进入产蛋期(产蛋率达50%)后的产蛋率、产蛋数、平均日采食量、平均日产蛋重和料蛋比(平均日采食量/平均日产蛋重)。蛋重、蛋形指数、蛋壳厚度、蛋黄质量、蛋黄比率、哈氏单位、蛋黄颜色和蛋壳强度参照《家禽生产性能名词术语和度量计算方法》(NY/T 823—2020)进行测定。

1.4.2 血清生化指标测定

血清生化指标使用全自动生化分析仪(型号为日立7600)进行检测。

1.4.3 肠黏膜形态学观察

取固定的十二指肠组织,按照常规方法制作组织切片。每个样本随机取5张肠道结构完整且绒毛伸展情况良好的组织切片,每张组织切片选择至少5个不同视野,用CaseViewer分析系统测量其绒毛高度、隐窝深度、绒毛宽度,计算绒腺比值(绒毛高度/隐窝深度)和绒毛表面积(2πrh;r为1/2的绒毛宽度,h为绒毛高度)。

1.4.4 肠道微生物扩增子测序分析

选取蛋鸡的盲肠内容物进行肠道微生物扩增子测序分析。首先对盲肠内容物进行DNA提取,并使用Nanodrop检测DNA样品质量;然后以16S rRNA-V4区为目标片段进行PCP扩展,扩增引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。将样本PCR扩增产物进行文库构建,通过Illumina NovaSeq平台测序及数据分析。随后,使用QIIME软件,对样品alpha多样性指数和beta多样性进行评估。

1.5 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析,并采用Duncan氏法多重比较组间差异显著性,结果以“平均值±标准差”表示。以P<0.05为差异显著性判断标准,以P<0.01为差异极显著性判断标准。

2 结 果

2.1 蚯蚓液对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响

由表3可知,各组蛋鸡在产蛋期的产蛋率、产蛋数、平均日采食量、平均日产蛋量和料蛋比差异均不显著(P>0.05)。

表3 蚯蚓液对蛋鸡产蛋性能的影响Table 3 Effects of earthworm hydrolysate on laying performance of laying hens

由表4可知,1%蚯蚓液组的蛋壳厚度极显著高于对照组(P<0.01),2%蚯蚓液组的蛋壳厚度显著高于对照组(P<0.05);1%蚯蚓液组的蛋壳强度显著高于对照组(P<0.05)。

表4 蚯蚓液对蛋鸡蛋品质的影响Table 4 Effects of earthworm hydrolysate on egg quality of laying hens

2.2 蚯蚓液对蛋鸡血清生化指标的影响

由表5可知,1%、2%和3%蚯蚓液组的血清肌酐含量极显著低于对照组(P<0.01);3%蚯蚓液组的血清尿酸含量显著低于对照组(P<0.05)。

表5 蚯蚓液对蛋鸡血清生化指标的影响Table 5 Effects of earthworm hydrolysate on serum biochemical indices of laying hens

2.3 蚯蚓液对蛋鸡肠黏膜形态的影响

由表6可知,各组蛋鸡肠黏膜的绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、绒腺比值、肌层厚度和绒毛表面积均差异不显著(P>0.05)。

表6 蚯蚓液对蛋鸡肠黏膜形态的影响Table 6 Effects of earthworm hydrolysate on intestinal mucosal morphology of laying hens

2.4 蚯蚓液对蛋鸡盲肠微生物多样性的影响

2.4.1 获得数据总体情况

12个样本测序共获得1 014 743对Reads,双端Reads质控、拼接后共产生947 242条 Clean Reads,每个样本至少产生71 961条Clean Reads,平均产生78 937条Clean Reads。

2.4.2 特有操作分类单元(OTUs)分析

由图1可知,4个组共有的OTUs数量为624个,对照组以及1%、2%和3%蚯蚓液组特有的OTUs数量分别为5、15、22和10个。

多个颜色图形之间交叠部分数字为多个组之间共有的OTUs数量,非交叠部分为各组特有的OTUs数量。The number in each overlapped area stands for number of common OTUs in multiple color graphics, the number in each non-overlapped area stands for number of unique OTUs in multiple color graphics.图1 各组蛋鸡肠道微生物的特有OTUs变化情况Fig.1 Changes of special OTUs of intestinal microbiome of laying hens in each group

2.4.3 alpha多样性

由图2可知,2%蚯蚓液组蛋鸡肠道微生物的ACE指数、Chao1指数、PD_whole_tree指数均显著高于对照组(P<0.05)。属水平物种累积曲线图(图3)显示,在一定范围内,随着样本量的加大,曲线趋于平缓,该结果表示本研究抽样充分,样品物种丰富,可以进行数据分析。

“*”表示组间差异显著(P<0.05)。“*” mean significant difference between groups (P<0.05).图2 alpha多样性指数组间差异柱状图Fig.2 Histogram of difference between groups for alpha diversity indexes

横坐标表示样本量;纵坐标表示抽样后物种数目;红色箱线组成累积曲线;绿色箱线组成共有量曲线。X-axis represents sample amount; Y-axis represents species number after sampling; red boxes form accumulation curve; green boxes form shared amount curve.图3 属水平物种累积曲线图Fig.3 Accumulation curve chart of species at genus level

2.4.4 beta多样性

图4左图为样品聚类树,根据图中分支情况分析得到,各组组间差异大于组内差异;图4右图为相对丰度排名前10的物种组成,图中显示,对照组和试验组(1%、2%和3%蚯蚓液组)肠道中的优势菌属均为拟杆菌属(Bacteroides)和粪杆菌属(Faecalibacterium),且各组肠道微生物中相对丰度排名前10的菌属相同。

C-1、C-2和C-3为对照组的3个样本,T1-1、T1-2和T1-3为1%蚯蚓液组的3个样本,T2-1、T2-2和T2-3为2%蚯蚓液组的3个样本,T3-1、T3-2和T3-3为3%蚯蚓液组的3个样本。右上方图注代表相对丰度排名前10的物种,排名在前10之外的物种归为其他,未注释到的物种归为未分类。C-1, C-2 and C-3 are 3 samples from control group, T1-1, T1-2 and T1-3 are 3 samples from 1% EH group, T2-1, T2-2 and T2-3 are 3 samples from 2% EH group, and T3-1, T3-2 and T3-3 are 3 samples from 3% EH group. The legend in the top right represents the top 10 species in relative abundance. Species outside the top 10 are classified as Others. Unannotated species are classified as Unclassified.图4 各组蛋鸡肠道微生物的聚类树与柱状图组合图Fig.4 Combining diagram of clustering tree and histogram of intestinal microbiome of laying hens in each group

2.4.5 肠道微生物相对丰度

根据微生物测序结果进行统计,对照组与试验组在门、目、科、属、种水平上均存在不同程度的差异。如表7所示,与对照组相比,在门水平上,1%、2%和3%蚯蚓液组蛋鸡的脱硫菌门(Desulfobacterota)、梭杆菌门(Fusobacteriota)相对丰度显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),2%蚯蚓液组蛋鸡的广古菌门(Euryarchaeota)相对丰度显著升高(P<0.05);在纲水平上,1%、2%和3%蚯蚓液组蛋鸡的梭杆菌纲(Fusobacteria)和甲烷杆菌纲(Methanobacteria)相对丰度显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01);在目水平上,1%、2%和3%蚯蚓液组蛋鸡的脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)相对丰度显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),1%和3%蚯蚓液组蛋鸡的RF39目极显著降低(P<0.01);在科水平上,2%蚯蚓液蛋鸡的巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)相对丰度显著降低(P<0.05),1%、2%和3%蚯蚓液组蛋鸡的脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)相对丰度显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),2%和3%蚯蚓液组蛋鸡的理研菌科(Rikenellaceae)相对丰度显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01);在属水平上,1%、2%和3%蚯蚓液组蛋鸡脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、梭杆菌属(Fusobacterium)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)相对丰度显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01);在种水平上,2%蚯蚓液组蛋鸡的Bacteroidescaecicola、粪居拟杆菌(Bacteroidescoprocola)和Megasphaerastantonii相对丰度均极显著上升(P<0.01),2%和3%蚯蚓液组蛋鸡的Desulfovibrio_bacterium_New_Zealand_D相对丰度极显著降低(P<0.01)。

表7 各组蛋鸡肠道微生物相对丰度的变化情况Table 7 Changes of intestinal microbial relative abundance of laying hens in each group

3 讨 论

3.1 蚯蚓液对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响

2021年,本课题组将蚯蚓液应用于105～175日龄的蛋鸡养殖,结果发现在饲粮中添加蚯蚓液对蛋鸡的产蛋性能无不良影响[9]。在课题组前期研究的基础上,本研究将蚯蚓液应用于13周龄蛋鸡的养殖,连续饲喂30周,检测其产蛋性能后发现,饲喂添加0、1%、2%和3%蚯蚓液饲粮的蛋鸡分别于131、131、128和130日龄开始产蛋,进入开产期;分别于144、145、143和142日龄产蛋率达50%,进入产蛋期;分别于157、151、153和154日龄产蛋率达90%,进入产蛋高峰期。由此可知,使用含蚯蚓液饲粮饲喂蛋鸡后,可使蛋鸡的开产期和产蛋高峰期提前,且不影响蛋鸡的产蛋率。综上可得,蚯蚓液在不影响蛋鸡产蛋率、产蛋数、平均日采食量、平均日产蛋重和料蛋比的前提下,可使蛋鸡的产蛋期和产蛋高峰期提前,有效增强产蛋性能。

蛋壳厚度和蛋壳强度对于鸡蛋的包装运输、孵化和食用安全等有重要意义[10]。本研究发现,蚯蚓液有助于蛋鸡蛋壳厚度和蛋壳强度的增加,该结果表明蚯蚓液提高了鸡蛋的蛋品质。

3.2 蚯蚓液对蛋鸡血清生化指标的影响

血清中的肌酐是机体肌肉代谢的产物,由磷酸肌酸代谢生成,是衡量肾脏过滤功能的常用指标,其含量越高,通常提示肾功能越差[11]。本研究中,使用蚯蚓液后蛋鸡的血清肌酐含量极显著下降,该结果表明,蚯蚓液可降低肾脏损伤,提高肾功能。蛋鸡痛风是一种代谢性疾病,主要由体内尿酸代谢异常引起,雏鸡、青年鸡和成年鸡均可发病,对养鸡业可造成严重影响[12]。而本研究发现,饲粮中添加不同水平的蚯蚓液可使蛋鸡的血清尿酸含量有不同程度的下降,且以添加3%蚯蚓液时效果最佳,该结果表明,蚯蚓液可能可以用于蛋鸡痛风病的预防,降低患病风险,然而其具体机制仍待进一步研究。

3.3 蚯蚓液对蛋鸡肠道健康的影响

鸡肠道结构和功能的完整对其健康具有重要意义。本研究结果发现,各组之间肠黏膜绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、绒腺比值、肌层厚度和绒毛表面积均差异均不显著,该结果表明蚯蚓液对蛋鸡肠道结构无不利影响。

蛋鸡盲肠中存在着大量的微生物,其对于维持家禽肠道微生态的稳定、促进营养物质的消化吸收发挥着非常重要的作用[13]。脱硫菌门是细菌门之一,属于有害菌[14]。脱硫弧菌目作为一种环境调节剂,可通过影响胆汁酸和胆固醇代谢来促进胆结石的形成[15]。脱硫弧菌属,属于脱硫弧菌科,也被称为硫酸盐还原菌(SRB),可产生硫化氢(H2S),被认为会对肠道上皮具产生毒性,导致胃肠道疾病[16]。本研究发现,给蛋鸡饲喂添加1%、2%或3%蚯蚓液的饲粮可使肠道中脱硫菌门、脱硫弧菌目、脱硫弧菌科和脱硫弧菌属的相对丰度均显著或极显著下降,该结果表明,蚯蚓液有降低胆结石患病风险,减少胃肠道疾病的作用。梭杆菌门与炎症性肠病(IBD)和肠道感染有关[17]。一些研究发现,梭杆菌门在结肠腺瘤组织中的含量明显高于正常组织[18]。梭杆菌目为梭杆菌纲的唯一目细菌,与结肠直肠癌有关[19]。梭杆菌科与机体的炎症性肠病-克罗恩病有关[20]。梭杆菌属是梭杆菌科的一个属,也与结肠直肠癌致病性相关[21]。本研究结果显示,给蛋鸡饲喂添加1%、2%或3%蚯蚓液的饲粮可使肠道中梭杆菌门、梭杆菌目、梭杆菌科和梭杆菌属的相对丰度显著或极显著下降,表明蚯蚓液有降低蛋鸡肠道炎性病、肠道感染以及直肠癌的潜在作用。甲烷短杆菌属属于广古菌门甲烷杆菌纲甲烷杆菌目下的甲烷杆菌科,是一种在厌氧条件下以甲烷为特异代谢产物的细菌[22],其代谢产物为甲烷和二氧化碳,是多种疾病重要指标[23]。本研究结果显示,给蛋鸡饲喂添加1%、2%或3%蚯蚓液的饲粮可使肠道中甲烷短杆菌属的相对丰度显著或极显著下降。综上可知,蚯蚓液有降低蛋鸡患病风险的作用。

理研菌科是一类重要的微生物,其具有广泛的生物学作用。首先,理研菌科中的一些物种可以产生抗生素,用于治疗疾病[24];其次,理研菌科中的另一些物种可以促进农业生产,例如促进植物生长和保护作物免受病害侵袭[25]。Bacteroidescaecicola可用于提高鸡肠道免疫力,具有显著的效果,可以在防治腹泻过程中减少保健用抗生素的使用量[26]。Megasphaerastantonii是一种从健康鸡盲肠中分离出的产丁酸盐细菌[27]。丁酸是肠道微生物发酵难消化碳水化合物生成的一种短链脂肪酸,是动物后段肠道上皮生长的主要能源物质[28]。研究显示,丁酸能促进肠系膜淋巴结发育,调节抗炎信号通路,改善肠道上皮屏障功能[29]。本研究发现,2%蚯蚓液组蛋鸡肠道中理研菌科、Bacteroidescaecicola和Megasphaerastantonii的相对丰度均显著或极显著上升,该结果表明,适量的蚯蚓液具有提高蛋鸡肠道免疫力的作用,有一定的替抗潜力。

4 结 论

本试验条件下,在13～43周龄蛋鸡饲粮中添加1%或2%的蚯蚓液能够显著增加蛋壳厚度,提高蛋品质;添加1%、2%或3%的蚯蚓液能够极显著降低蛋鸡血清肌酐含量,有提高肾功能的作用。此外,在不影响蛋鸡十二指肠形态学指标的前提下,蚯蚓液能够调节肠道菌群,降低脱硫弧菌门、脱硫弧菌目、脱硫弧菌科、脱硫弧菌属、梭杆菌门、梭杆菌目、梭杆菌科、梭杆菌属、广古菌门、甲烷杆菌纲、甲烷杆菌目、甲烷杆菌科、甲烷短杆菌属等有害菌的相对丰度,并提高理研菌科、Bacteroidescaecicola和Megasphaerastantonii等有益菌的相对丰度。