姜黄提取物与石榴皮提取物的复合物对文昌鸡生长性能、血清免疫指标和盲肠微生物的影响

张谚鹏 林 苗 肖亚红 温刘发

(华南农业大学动物科学学院,广州 510642)

我国是肉鸡产业大国,禽饲用添加剂的开发具有重要意义。自“禁抗”以来,不少学者都在研究开发替代抗生素的添加剂来稳定或提高肉鸡生长性能,此前已开发出诸多可行的植物提取物[1]。其中,姜黄提取物与石榴皮提取物具有多种生物学活性,可作为抗生素的替代物应用于肉鸡生产中。

姜黄提取物含有姜黄素类与挥发油类化合物,还含有黄酮类、糖类、多肽类、脂肪酸和微量元素[2]。姜黄乙醚和甲醇提取物对多种革兰氏阳性菌存在抑菌潜力[3],其中的挥发油类化合物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠埃希菌等有较强的抑菌活性[4]。此外,姜黄素类化合物对炎症性疾病(关节炎、炎症性肠道疾病、牛皮癣、皮炎)和神经病理性疼痛有良好的预防和治疗作用[5]。研究显示,饲粮中添加487.5 mg/kg的姜黄素能显著提高舍饲羔羊的平均日增重[6]。石榴皮提取物主要成分是鞣质类、黄酮类和生物碱类,次要成分有氨基酸、糖类等。有体外试验表明,鞣质类成分鞣花酸对白色念珠菌、新生隐球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、烟曲霉菌和胞内分枝杆菌等具有抗菌活性[7]。石榴皮煎剂能降低炎症模型小鼠的血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和分泌型免疫球蛋白(sIgA)的含量,提高小鼠免疫力[8]。另有研究显示,50 mg/kg石榴皮甲醇提取物对胃溃疡模型大鼠溃疡的抑制率达到65.87%[9],表明石榴皮甲醇提取物能缓解消化道疾病;饲粮中添加2.0%的石榴皮粉能提高拜城油鸡的平均日增重和屠宰率[10],有利于禽类养殖。

目前的研究报道多是单一的姜黄提取物、石榴皮提取物或二者分别与其他植物提取物联合应用于畜禽养殖中,有关二者联合应用于禽类养殖则鲜有报道。与此同时,单独应用某一种植物提取物的效果很少能与抗生素相当,且不同的试验条件和动物模型导致结果差别很大。本研究拟将姜黄提取物和石榴皮提取物联合应用于文昌鸡的养殖中,探究其对文昌鸡生长性能、血清免疫指标和盲肠微生物的影响,期望能在饲养效果上有良好、稳定地表现,使其作为无害有效的饲料添加剂投入到实际生产中,以期为多种植物提取物联合应用于禽业养殖中提供借鉴和依据,丰富复合提取物的研究资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

石榴皮提取物(10∶1,即10 kg石榴皮通过水提得到1 kg提取物),其主要成分是鞣质类、黄酮类和生物碱类,次要成分为氨基酸和糖类等;姜黄提取物(10∶1,即10 kg姜黄通过水提得到1 kg提取物),主要成分是姜黄素类与挥发油类化合物,次要成分有黄酮类、糖类、多肽类、脂肪酸和微量元素。以上二者均购自西安某生物工程有限公司。姜黄提取物与石榴皮提取物的提取工艺流程为:挑选原料→粉碎→水提→浓缩→浸膏→溶剂萃取→浓缩→浸膏→喷雾干燥→粉碎→提取物。按1∶1的比例将石榴皮提取物与姜黄提取物混合均匀制成复合提取物,在饲粮中添加时以玉米芯粉和麦饭石为载体配制成预混剂。

1.2 试验设计

选取57日龄文昌鸡母鸡1 260只,随机分为7组,每组5个重复,每个重复36只,开始试验前各重复体重差异不显著(P>0.05),均匀度整齐。对照组饲喂不添加复合提取物的基础饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮中添加100、200、400、800、1 600和3 200 g/t复合提取物的试验饲粮,试验期为35 d。基础饲粮依据中华人民共和国农业行业标准《鸡的饲养标准》(NY/T 33—2004)配制,其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) kg/t

1.3 饲养管理

饲养试验在惠州京基智农畜牧有限公司鸡场进行。试验鸡采用笼养模式,各组饲养管理方式、饲养环境条件一致。试验期间试验鸡自由采食粉料,保证料槽余料充足;自由饮水,除了开始试验时使用多维抗应激外,未使用其他添加剂或药物;每天24 h光照(白天自然光照,晚上开照明灯补光);疫苗接种按照鸡场的免疫程序执行;定期配制试验饲粮,定期进行水线的清洁、地面的冲洗。

1.4 样品采集与指标检测

1.4.1 生长性能的测定

饲养试验开始时称量试验鸡空腹体重,记为初始体重,饲养试验结束时称量试验鸡空腹体重,记为终末体重。在饲养试验期间,每天观察鸡群的健康状况,记录每日投料、余料及鸡只死淘情况。根据记录的数据,计算试验鸡的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和死亡率(MR)。

1.4.2 血清的采集与免疫指标的检测

挑选每个重复中最接近该重复平均体重的5只鸡进行采样,采样前进行12 h的饥饿处理。通过颈动脉放血,用10 mL离心管接血液(2/3容积),避免污染,每只鸡采集2管血液;将盛有血液的离心管置于离心管架上,室温倾斜放置1～2 h后,用离心机以3 000 r/min的转速离心10 min,完毕后取上清1.5 mL,装于2只2 mL离心管中,标明组别后放到样品袋,转到干冰箱暂存后存入-20 ℃冰箱,待测血清免疫指标。

血清中免疫球蛋白G(IgG)、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-1β、IL-6、脂多糖(LPS)含量均采用对应试剂盒(IgG、LPS、IFN-γ试剂盒由南京建成生物工程研究所生产,IL-1β、IL-6试剂盒由广州东林生物科技有限公司生产)通过全自动生化分析仪进行检测。

1.4.3 盲肠微生物样采集与检测

1.4.3.1 采集

将采血后的鸡只屠宰,剪下每只鸡的2条盲肠,用棉线在回盲韧带处结扎,一条盲肠置于5 mL离心管中,编号,置于有干冰的泡沫箱中,并于当日转至-20 ℃冰箱中保存;另一条盲肠剪开后用镊子挤压收集内容物于无菌冻存管内,将无菌冻存管放入干冰中,之后于-80 ℃保存,待检。

1.4.3.2 盲肠微生物检测

本试验所有盲肠微生物样本的扩增、测序和物种注释流程均由深圳微生太科技有限公司完成,具体流程如下。

(1)DNA抽提和PCR扩增

根据E.Z.N.A.®soi试剂盒说明书进行总DNA抽提,用NanoDrop2000分光光度计检测DNA浓度和纯度,1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量;用338F(5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物对V3～V4可变区进行PCR扩增(PCR仪:ABI geneamp®9700型),扩增程序为:95 ℃预变性3 min,27个循环(95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。扩增体系为20 μL,包含4 μL 5×FastPfu缓冲液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶,10 ng DNA模板,由超纯水补至20 μL。

(2)文库构建与测序

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行纯化,Tris-HCl洗脱,2%琼脂糖凝胶电泳检测,用QuantiFluorTM-ST进行定量检测,根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300的文库。利用Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序。

(3)物种注释

将原始序列fastq文件通过qiime tools import插件转化文件格式,然后运用QIIME2 dada2插件进行质控、修剪、去噪、拼接和去嵌合体得到特征序列。运用QIIME2 feature-classifier插件将扩增特征序列(ASV)的代表序列(根据338F/806R引物对将数据库修剪到V3～V4区域)与Greengenes数据库比对,得到物种的分类信息表。

(4)α多样性及相关性分析

α多样性及相关性分析主要用qiime2 diversity插件完成。

1.5 数据处理与统计分析

使用Excel 2019对数据进行计算,并使用SPSS 23.0统计软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行方差分析,组间多重比较采用Duncan氏法,以P<0.05作为差异显著性判断标准,统计数据用平均值±标准误(mean±SE)表示。

2 结 果

2.1 复合提取物对文昌鸡生长性能的影响

由表2可知,试验开始前各组间初始体重无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,添加200、400 g/t复合提取物显著提高了文昌鸡的终末体重和平均日增重(P<0.05);添加400 g/t复合提取物显著提高了文昌鸡的平均日采食量(P<0.05);添加200 g/t复合提取物显著降低了文昌鸡的料重比(P<0.05)。

表2 复合提取物对文昌鸡生长性能的影响Table 2 Effects of compound extract on growth performance of Wenchang broilers

以复合提取物添加量100、200、400、800 g/t为自变量(M),分别以平均日增重、平均日采食量和料重比为因变量(N)展开线性分析,其调整后R2、P值及线性回归方程如表3所示。由表3可知,平均日增重无法建立线性模型,不能进一步分析;平均日采食量和料重比可以建立线性方程,但从调整后R2及P值可知,这2个指标的线性分析预测结果准确性不高,无法下定结论。因此,又以复合提取物添加量100、200、400、800 g/t为自变量(X),分别以平均日增重、平均日采食量和料重比为因变量(Y)进行二次曲线分析,3个指标调整后R2、P值及二次曲线方程如表4所示,二次回归图如图1所示。由表4可知,平均日采食量和料重比与复合提取物的二线曲线调整后R2较低,拟合程度低,而平均日采食量是这3个指标中二次曲线拟合度最好的;从3个指标的P值来看,均无显著性差异,但平均日采食量更加有线性的趋势;由图1可知,平均日采食量的数据点更接近曲线。综上所述,复合提取物添加量通过影响3个指标中的平均日采食量,进而影响生长性能的解释更科学合理,由其二次曲线方程得出,当复合提取物添加量为481.45 g/t时,平均日采食量最高,生长性能最好。

图1 平均日增重、平均日采食量和料重比与复合提取物添加量的二次回归图Fig.1 Quadratic regression diagram of ADG, ADFI, F/G and compound extract supplemental level

表3 平均日增重、平均日采食量和料重比(N)与复合提取物添加量(M)的线性分析Table 3 Linear analysis of ADG, ADFI, F/G (N) and compound extract supplemental level (M)

表4 平均日增重、平均日采食量和料重比(Y)与复合提取物添加量(X)的二次曲线分析Table 4 Quadratic curve analysis of ADG, ADFI, F/G (Y) and compound extract supplemental level (X)

2.2 复合提取物对文昌鸡血清免疫指标的影响

由表5可知,与对照组相比,添加3 200 g/t复合提取物显著提高了文昌鸡血清中IFN-γ含量(P<0.05),显著降低了血清中IL-1β含量(P<0.05);各添加复合提取物组文昌鸡血清中IgG、IL-6、LPS含量均显著降低(P<0.05)。

表5 复合提取物对文昌鸡血清免疫指标的影响Table 5 Effects of compound extract on serum immune indexes of Wenchang broilers

2.3 复合提取物对文昌鸡盲肠微生物的影响

2.3.1 测序结果

经Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序,40个样本得到全部原始序列数为2 656 290,进行质量控制、去噪、拼接、去嵌合体,形成操作分类单元(OTU)。所有原始序列得到OTU数为2 082 884,质量控制比例为78.41%。

2.3.2 注释信息基础统计

根据物种绝对丰度表,基于Greengenes数据库的注释信息,全部样本的Feture sequence从2个界[细菌界(Bacteria)、古细菌界(Archaea)]中共筛选出13个门,22个纲,30个目,46个科,79个属和113个种。

根据门相对丰度表,基于Greengenes数据库的注释信息得到所有样本门水平的注释信息,如图2所示。由图2可知,相对丰度排在前6的门有拟杆菌门(Bacteroidetes,48.37%)、厚壁菌门(Firmicutes,41.77%)、变形菌门(Proteobacteria,4.28%)、互养菌门(Synergistetes,1.66%)、放线菌门(Actinobacteria,1.56%)、脱铁杆菌门(Deferribacteres,0.61%)。

Bacteroidetes:拟杆菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Proteobacteria:变形菌门;Synergistetes:互养菌门;Actinobacteria:放线菌门;Deferribacteres:脱铁杆菌门;Fusobacteria:梭杆菌门;Elusimicrobia:迷踪菌门;Spirochaetes:螺旋体门;Verrucomicrobia:疣微菌门;Lentisphaerae:黏胶球形菌门;Tenericutes:软壁菌门;Unclassified:未分类。图2 文昌鸡盲肠微生物门水平物种组成Fig.2 Species composition of cecal microbiota at phylum level of Wenchang broilers

根据属相对丰度表,基于Greengenes数据库的注释信息,得到所有样本属水平的注释信息,如图3所示。由图3可知,相对丰度排在前8的属有拟杆菌属(Bacteroides,24.40%)、瘤胃球菌属(Ruminococcus,6.59%)、巴恩斯氏菌属(Barnesiella,5.60%)、巨单胞菌属(Megamonas,5.17%)、Papillibacter(3.40%)、普氏菌属(Prevotella,2.96%)、梭菌属(Clostridium,2.77%)、粪杆菌属(Faecalibacterium,2.61%)。

Unclassified:未分类;Bacteroides:拟杆菌属;Ruminococcus:瘤胃球菌属;Barnesiella:巴恩斯氏菌属;Megamonas:巨单胞菌属;Prevotella:普氏菌属;Ruminococcaceae_Clostridium:瘤胃球菌科梭菌属;Faecalibacterium:粪杆菌属;Dethiosulfovibrio:脱硫代硫酸盐弧菌属;Lachnospiraceae_Clostridium:毛螺菌科梭菌属;Desulfovibrio:脱硫弧菌属;Alistipes:另枝菌属;Selenomonas:月形单胞菌属;Butyricicoccus:丁酸球菌属;Lactobacillus:乳杆菌属;Oscillospira:颤螺旋菌属;Gemmiger:芽殖菌属;Sporobacter:孢杆菌属;Other:其他。图3 文昌鸡盲肠微生物属水平物种组成Fig.3 Species composition of cecal microbiota at genus level of Wenchang broilers

2.3.3 α多样性分析

由表6中的Goods_coverage指数可以得出,所有样本的注释情况良好,此次测序结果能反映出样本中微生物的真实情况。与对照组相比,各添加复合提取物组的Chao1、Ace、Simpson指数无显著差异(P>0.05)。与添加100 g/t复合提取物组相比,添加3 200 g/t复合提取物组Shannon指数显著降低(P<0.05)。

表6 复合提取物对文昌鸡盲肠微生物α多样性的影响Table 6 Effects of compound extract on cecal microbial α diversity of Wenchang broilers

2.3.4 菌属差异性

由表7可知,与对照组相比,添加100 g/t复合提取物组文昌鸡的乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度显著增高(P<0.05),而添加400、3 200 g/t复合提取物组无显著性差异(P>0.05),但有提高其相对丰度的趋势;添加400、3 200 g/t复合提取物组的颤螺旋菌属(Oscillospira)相对丰度显著降低(P<0.05)。与添加100 g/t复合提取物组相比,添加400 g/t复合提取物组的优杆菌属(Eubacterium)相对丰度显著增高(P<0.05)。

表7 复合提取物对文昌鸡9个菌属相对丰度的影响Table 7 Effects of compound extract on relative abundances of 9 bacterial genera of Wenchang broilers %

2.3.5 相关性分析

Pheatmap可用于分析环境因子或其他临床表型数据与微生物群落或物种之间是否显著相关。对文昌鸡盲肠微生物中部分菌属的相对丰度与复合提取物添加量、文昌鸡平均日增重进行相关性分析,结果如图4所示。由图4可知,文昌鸡盲肠微生物中Asteroleplasma、优杆菌属、欧陆森氏菌属(Olsenella)的相对丰度与平均日增重呈显著正相关(P<0.05),文昌鸡盲肠微生物中瘤胃球菌科梭菌属(Ruminococcaceae_Clostridium)、Papillibacter、Desulfosporosinus、颤螺旋菌属、罗氏菌属(Roseburia)、毛螺菌科梭菌属(Lachnospiraceae_Clostridium)的相对丰度与复合提取物添加量呈显著负相关(P<0.05)。

X轴为影响因子,Y轴为物种,同时,左边的色条标注了物种所属门分类。通过计算获得R值(秩相关)和P值。R值在图中以不同颜色展示,右侧图例是不同R值的颜色区间。P值小于0.05表示存在显著相关,其中0.01≤P<0.05用*标注,0.001≤P<0.01用**标注。The X-axis represents the influencing factor and the Y-axis represents species. The color bar on the left marks the classification of the phylum to which the species belongs. R value (rank correlation) and P-value were obtained by calculation. Wherein, the R value is displayed in different colors in the graph, and the legend on the right shows the color range of different R values. A P-value less than 0.05 indicates a significant correlation. 0.01≤P<0.05 is marked with *, and 0.001≤P<0.01 is marked with **.ADG:平均日增重 average daily gain;AL:复合提取物添加量 compound extract supplemental level;Phylum:门;Actinobacteria:放线菌门;Firmicutes:厚壁菌门;Asteroleplasma:无甾醇原体属;Eubacterium:优杆菌属;Olsenella:欧陆森氏菌属;Ruminococcaceae_Clostridium:瘤胃球菌科梭菌属;Oscillospira:颤螺旋菌属;Roseburia:罗氏菌属;Lachnospiraceae_Clostridium:毛螺菌科梭菌属。图4 文昌鸡盲肠微生物相关性分析Fig.4 Correlation analysis of cecal microbiota of Wenchang broilers

3 讨 论

3.1 复合提取物对文昌鸡生长性能的影响

目前植物提取物在肉鸡上的应用效果已初步显现,如山香圆叶、夜交藤、丝兰、博落回、五味子和连翘等[11-12]。单一使用某些植物提取物对肉鸡的生长性能存在无提升或提升不明显的现象。例如,周璐丽等[13]在基础饲粮中添加300 mg/kg姜黄提取物饲养文昌鸡9周,其平均日增重无显著提升;樊祥宇等[14]在饲粮中添加100或200 mg/kg姜黄素显著降低了29～70日龄中速型黄羽肉鸡的平均日采食量,但试验全期平均日增重无显著变化。此外,某些植物提取物需要添加过高剂量才发挥效果。例如,李婉雁等[15]的研究显示,在基础饲粮中添加5 000 mg/kg姜黄粉才能显著提高试验鸡的全期增重和降低料重比;黄飘飘等[10]报道,在饲粮中添加2%(20 000 mg/kg)的石榴皮粉时拜城油鸡的平均日增重才显著高于对照组。

本试验结果显示,添加200、400 g/t复合提取物显著提高了文昌鸡的平均日增重;添加400 g/t复合提取物显著提高了文昌鸡的平均日采食量;添加200 g/t复合提取物显著降低了文昌鸡的料重比。这是因为姜黄提取物中的姜黄素具有较好的抗炎活性,能减少胃肠道炎症来保护肠道,有利于肠腔对营养物质的吸收[16];石榴皮中的鞣花酸的抑菌谱广[7],能降低胃肠道疾病发生率[9],促进肠道健康,使机体蛋白质沉积加快,促进生长。上述试验结果也表明姜黄提取物与石榴皮提取物联合使用效果良好,中、低添加剂量就能提升文昌鸡的生长性能,比起二者单独使用的效果要好,复合提取物有着使用剂量小、效果优的特点。根据二次曲线分析数据可知,以复合提取物添加量为自变量、平均日采食量为因变量二次回归分析的调整后R2较高,二次回归方程拟合度较好,其呈现出的规律性较强且P值相对而言更接近显著;以平均日增重为因变量时,调整后R2较低,二次回归方程拟合度较差,其呈现出的规律性弱且P值较大;而以料重比为因变量时,调整后R2为负数,在此不做讨论。因此,本试验以平均日采食量进行分析更加科学、合理,通过二次回归方程计算得出,当复合提取物添加量为481.45 g/t时,文昌鸡的平均日采食量最高,生长性能最好。姜黄提取物与石榴皮提取物联合使用可能存在某种正向靶点,不仅提高采食量,还使文昌鸡拥有良好的肠道环境和健康水平,促进营养物质吸收,最终提高文昌鸡的生长性能。

3.2 复合提取物对文昌鸡血清免疫指标的影响

免疫球蛋白(Ig)由B淋巴细胞产生,能和抗原特异性结合,广泛分布于动物血清、组织液,从Ig含量的变化可以看出动物的免疫水平[17]。本研究中,添加400 g/t复合提取物显著降低了文昌鸡血清中IgG含量,而荀文娟等[18]在基础饲粮添加300或400 mg/kg姜黄素均能显著提高早期断奶仔猪血清中IgG含量,Hosseini-Vashan等[19]在饲粮中添加15、30或50 g/kg经尿素处理的石榴皮至热应激肉鸡42日龄,其血清中IgG含量显著上升。本结果与上述学者试验结果存在差异的原因可能是本试验所用复合提取物含有的功效成分姜黄素与鞣花酸发挥出与IgG类似的作用,当机体发生免疫反应时就不会产生过多的IgG,而由姜黄素、鞣花酸发挥作用,这使得机体用于合成免疫的蛋白质减少,用于生长的蛋白质量增加,有利于鸡的增重。本试验中,添加3 200 g/t复合提取物组血清中IFN-γ含量显著升高,表明添加高水平的复合提取物促进了机体IFN-γ的表达,进而提高机体的免疫能力。李云等[20]在研究石榴皮多糖的免疫调节作用时发现,石榴皮多糖组中干扰素的含量比模型组显著增高,且石榴皮多糖浓度越高,改善的效果越明显,呈剂量效应关系,本试验结果与此相符。

IL-1β为促炎因子,与细胞繁殖、分化和凋亡相关[21]。本试验中,添加3 200 g/t复合提取物显著降低了文昌鸡血清中IL-1β含量,但添加400 g/t复合提取物显著增加了文昌鸡血清中IL-1β含量,这可能与该组鸡平均日采食量、平均日增重较高有关,当机体细胞生长繁殖速度快时,机体会产生更多的IL-1β。IL-6有调节免疫应答、造血功能等功能[22]。在本研究中,添加100、400、3 200 g/t复合提取物均显著降低了血清中IL-6含量,表明饲粮中复合提取物的添加使得文昌鸡保持在较低的炎症水平,具有良好免疫应答能力。孙慧男等[23]的试验表明,5～30 μmoL/L的姜黄素显著抑制LPS诱导肺泡上皮细胞炎症产生的IL-6;饲粮中添加300或400 mg/kg姜黄素可显著降低断奶仔猪空肠黏膜中IL-1β、IL-6的相对表达量[24]。本结果与上述研究结果相似,饲粮添加适量的复合提取物能降低文昌鸡血清中IL-6、IL-1β含量,减少机体炎症发生,促进机体健康,提高生长性能。其作用机制为,姜黄素能够阻断核因子-κB(NF-κB)信号通路,抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体聚集,从而中断IL-1β释放,达到抑制炎症反应的效果[25]。

LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,在细菌死亡或快速生长时释放,能诱导畜禽产生炎症。本试验中,添加100、400、3 200 g/t复合提取物均显著降低了文昌鸡血清中LPS含量,表明添加复合提取物能降低文昌鸡的炎症水平,提高其免疫能力。Rajput等[26]给雏鸡饲喂含200 mg/kg姜黄素的基础饲粮,在42 d时显著提高LPS诱导的雏鸡B淋巴细胞和T淋巴细胞的活性,且饲喂含姜黄素饲粮的雏鸡表现出更好的免疫反应;饲粮中添加β-胡萝卜素、姜黄素、大蒜素能够显著上调蛋白酶激活亚基3(PSME3)、蛋白酶激活亚基4(PSME4)基因的表达,增强雏鸡空肠免疫力[27];鞣花酸在体内与体外试验中均可调节LPS诱导的炎症因子表达,阻断LPS-Toll样受体4(TLR4)-NF-κB信号通路[28]。本试验结果表明,饲粮中添加复合提取物能降低由LPS所致的肠屏结构损伤,减少肠道炎症的发生,促进文昌鸡机体健康。

3.3 复合提取物对文昌鸡盲肠微生物的影响

3.3.1 注释信息统计分析

肠道是畜禽最大的细菌库,随着测序技术的发展,我们可以研究实验室不能培养出的肠道微生物。注释信息统计结果显示,文昌鸡的盲肠微生物优势菌门为拟杆菌门(48.37%)、厚壁菌门(41.77%)、变形菌门(4.28%)、互养菌门(1.66%)、放线菌门(1.56%)。家禽的肠道微生物是复杂而多样的,家禽从出生至第4周盲肠微生物多样性呈增加趋势,从第4周到第16周开始下降,而4周后厚壁菌门的相对丰度增加,变形菌门的相对丰度降低[29],本试验结束于文昌鸡的93日龄,因而从菌门比例上看,厚壁菌门较高而变形菌门较低。

3.3.2 α多样性分析

α多样性能反映一个群落内物种的多样性,在本研究中则反映某个样品中物种的复杂程度。α多样性通过α多样性指数呈现,Chao1、Ace指数可以评估一个样本中OTU数目的多少,是反映菌群丰度的指数,其数值越大,代表OTU数目越多,某种群数目越多;Shannon、Simpson指数是用来估计样品中物种多样性的指数,二者数值越大,其物种多样性越高;Goods_coverage指数是测序深度指数,反映的是样品特征序列与数据库的注释情况,其数值越大,注释水平越好,最大值为1。

本试验中,从Goods_coverage指数可以看出,所有样本的注释情况良好,此次测序结果能反映出样本中微生物的真实情况。各组Chao1、Ace、Simpson指数无显著差异,而添加3 200 g/t复合提取物组的Shannon指数比添加100 g/t复合提取物组显著降低,表明过高剂量的添加复合提取物会使文昌鸡盲肠微生物的多样性降低,从Chao1、Ace、Simpson指数的数值上看也能推测出该推论。

3.3.3 菌属差异分析

拟杆菌门是肠道生态系统中非常成功的竞争者,具有强大的营养灵活性和宿主肠道环境适应能力,其组成和代谢活动在很大程度上受饲粮调节,与脂肪和蛋白质的摄入量有关。菌属差异分析结果显示,文昌鸡盲肠微生物中拟杆菌门占比最高,可能与文昌鸡后期饲粮油脂含量偏高有一定关系。厚壁门大多属于有益菌,乳杆菌属于该门类,高纤维的饲粮可以增加肠道中厚壁菌门的数量。变形菌门是革兰氏阴性菌,大多属于病原菌,如大肠杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等著名的致病菌属均属于该门类。放线菌门因在某一发育阶段形成分枝细丝而得名,该门有益菌和有害菌都包含。

正常菌群与宿主之间、正常菌群之间通过营养竞争、代谢产物等相互制约,维持着良好的生存平衡,当这种平衡被打破,有些正常菌群就会变成致病菌群,这类菌群称为条件致病菌。本研究中,我们统计了5种有益菌属(双歧杆菌属、优杆菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、颤螺旋菌属)和4种条件致病菌属(链球菌属、梭菌属、埃希氏菌属、肠球菌属)的相对丰度,分析其组间差异,以寻找肠道有益菌群、条件致病菌群与复合提取物添加量的关系。由试验结果可知,4种条件致病菌的相对丰度在各组间均无显著差异,表明试验期间饲粮添加复合提取物并不会给肉鸡盲肠中条件致病菌创造有利条件而产生肠道危害,利于肉鸡肠道微生态和谐。对于有益菌而言,优杆菌属的许多菌种可产生的短链脂肪酸、保护肠道黏膜屏障、降低炎症水平和增强胃肠道运动机能,对机体营养代谢和维持肠道平衡有重要的作用。添加400 g/t复合提取物组优杆菌属的相对丰度比添加100 g/t复合提取物组显著增高,虽与较对照组相比无显著差异,但有增加的趋势。颤螺菌属可以产生丁酸盐等,被称为下一代益生菌的候选者,有研究发现它与体质变瘦呈正相关,颤螺菌可能具有减肥、降脂、缓解代谢综合征等作用。本试验中,添加400、3 200 g/t复合提取物组颤螺旋菌属的相对丰度较对照组显著降低,颤螺旋菌属数量减少,有利于试验鸡增重的提升。乳杆菌属能与肠道黏膜上皮细胞紧密结合形成“占位性”保护,并且通过增加顶端紧密连接的细胞间完整性来维持肠道渗透性;在与肠道上皮细胞的联合作用下,乳杆菌会刺激肠上皮杯状细胞,使杯状细胞产生大量黏液,阻止致病菌侵入肠上皮[30]。添加100 g/t复合提取物组乳杆菌属的相对丰度较对照组显著增高,添加400、3 200 g/t复合提取物组与对照组无显著差异,但有提高的趋势,这表明饲粮添加适量的复合提取物能够提高文昌鸡肠道微生物中乳杆菌属的相对丰度,改善肠道健康,提高免疫能力,促进其健康生长。

目前,有关研究已表明肉鸡肠道微生物的组成与宿主生长和健康密切相关,肠道菌群的竞争和自我调节影响着肉鸡肠道稳态与体重变化,微生物可能通过自身的碳水化合物代谢和脂质代谢影响肉鸡的免疫水平和能量代谢水平,进而影响体重。

在本试验中,基于属水平相对丰度表,对文昌鸡盲肠微生物部分菌属的相对丰度与复合提取物添加量、文昌鸡的平均日增重的相关性进行了分析,结果表明Asteroleplasma、优杆菌属、欧陆森氏菌属这3个菌属的相对丰度与文昌鸡的平均日增重显著正相关,推测饲粮中添加复合提取物能够提高文昌鸡盲肠微生物中这3个菌属的相对丰度,这3个菌属通过菌群互作或产生有益于宿主的物质对文昌鸡肠道健康、营养吸收产生有利影响,从而提高平均日增重,促进文昌鸡的生长。随着复合提取物添加量的提升,文昌鸡盲肠微生物中瘤胃球菌科梭菌属、Papillibacter、Desulfosporosinus、颤螺旋菌属、罗氏菌属、毛螺菌科梭菌属的相对丰度降低,推测高剂量添加复合提取物会使文昌鸡盲肠微生物丰富度降低,这与复合提取物中功效成分姜黄素、鞣花酸的抑菌生物活性有关,另一种可能是姜黄素、鞣花酸对这些菌属存在“特异性”抑制,使得其相对丰度降低。

4 结 论

饲粮中添加400 g/t的复合提取物能改善文昌鸡肠道微生态,增强机体免疫能力,使文昌鸡的平均日采食量得到改善,进而提高平均日增重,最终提高生长性能;通过二次回归方程得出,当复合提取物添加量为481.45 g/t时,文昌鸡的平均日采食量最高。此外,文昌鸡盲肠微生物中Asteroleplasma、优杆菌属、欧陆森氏菌属的相对丰度与平均日增重呈显著正相关,过高添加量的复合提取物会降低文昌鸡盲肠微生物的丰富度。