3D打印磷酸镁铵/聚己内酯引导骨再生支撑性膜的制备及其生物学性能的研究

刘蕴贤 朱蓉蓉 常晓峰 李哲

引导骨再生术（guided bone regeneration，GBR）因为其操作简便、技术敏感性低、结果可靠等优点，目前已成为临床种植中骨增量最常用的技术之一［1］。维持稳定且充足的成骨空间对于GBR至关重要，临床工作中常使用不同类型的GBR膜来达到这一目的。临床上最常使用的可吸收胶原膜因其机械性能差，不具备支撑能力，易导致成骨空间的早期塌陷［2］。因此，在进行大范围骨增量或垂直骨增量时，需要使用机械强度高的GBR支撑性膜来维持成骨空间。目前临床上最常使用的支撑性膜是各种类型的钛网，其良好的机械强度提供了足够的空间支撑。但钛网不可降解，。因此，亟待开发出一种兼具良好机械强度和生物降解性的支撑性膜以解决目前GBR所面临的困境。

目前，各种高分子聚合物已被广泛应用于生物和医学领域。聚己内酯（PCL）因其良好的生物安全性已获得美国食品和药物管理局（FDA）批准用于生物医学领域。同时，PCL还具备良好的机械强度和可生物降解性［4］。此外，PCL优异的可加工性使它可以通过熔融沉积建模（FDM）3D打印方法制备成具有特定形状、孔径和孔隙率的支架，有利于营养物质的运输和组织的生长，并使其能够很好的应用于各类复杂的骨缺损形态［5］。但PCL表现为疏水性，这会抑制细胞黏附和增殖［6］，不具备显著的促成骨能力［7］。因此，单纯使用PCL并不能制备出理想的GBR支撑性膜。有研究表明，在PCL中掺杂其他物质可以显著提高其亲水性和生物相容性［8］。磷酸镁骨水泥因其优异的成骨潜力而被认为可作为经典磷酸钙骨替代物的更优选择［9］。镁是天然骨组织中的重要元素，镁离子（Mg2＋）具有多种生物学特性，包括抗菌活性、调节炎症和促进成骨等［10］。与其他磷酸镁骨水泥（如Mg3（PO4）2、MgHPO4等）相比，磷酸镁铵（MNP，MgNH4PO4·6H2O）具有更好的溶解度、生物相容性和促成骨潜能，极具发展前景［11］。

综上所述，本研究拟采用MNP作为功能性添加物，PCL作为打印基材，采用FDM 3D打印技术制备复合GBR支撑性膜（MNP／PCL膜）。而混合材料的3D打印一直被认为是一项工艺难点，其均质程度及添加物的比例会对3D打印的成功率、成品的工艺精度和机械强度产生极大的影响［12］。因此，研究拟设计不同的MgNH4PO4·6H2O比例，以寻找最佳打印模型、合成比例及打印参数。样品打印后，对其进行理化性能表征，并探究其生物相容性和促成骨潜能。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

PCL颗粒（Mn＝80 000 Da）、六水合磷酸镁铵（MNP；MgNH4PO4·6H2O）、碳酸二甲酯（DMC）、氯化十六烷基吡啶（CPC）（上海麦克林生化有限公司）；CCK-8试剂盒（武汉博士德）；活／死细胞染色试剂盒（上海贝博）；ALP染色试剂盒、茜素红S溶液（北京索莱宝）；Trizol试剂、SPARKscriptⅡRT Plus试剂盒、SYBR Green qPCRMix（青岛思科捷）；扫描电子显微镜（SEM，S-4800，日立，日本）；电子万能试验机（EZ-SX，Shimadzu，日本）；接触角仪（DSA100S，Kruss，德国）；酶标仪（Multiskan FC，Thermo Fisher Scientific，美国）；激光扫描共聚焦显微镜（FV3000，奥林巴斯，日本）。

1.2 MNP／PCL膜的制备

以DMC作为溶剂，采用溶液共混法得到均匀的MNP／PCL／DMC溶液，随后经过超低温冻干去除DMC，最终得到海绵状的MNP／PCL混合物。纯PCL亦经过上述加工。使用FDM 3D打印机进行材料打印。3D打印模型层数设定为4层，打印尺寸为25 mm×25 mm，打印间距700μm，打印喷头孔径250μm，层间交角为45°／135°／0°／90°（图1）。充填结构的孔径为150～400μm，有利于新生骨组织和血管的生长［13］。

图1 3D打印模型Fig 1 Models of 3D printing

1.3 表面形貌表征

通过扫描电子显微镜观察膜的表面形态并评价打印精度。

1.4 力学性能表征

使用电子万能试验机进行拉伸性能测试（n＝3）。

1.5 亲水性检测

采用接触角仪测量表面亲水性。将1μL水滴加到每个样品的表面，30 s后测量接触角（n＝3）。

1.6 体外生物相容性评价

1.6.1 细胞增殖检测 将MC3T3-E1接种在膜表面，孵育1、3、5 d后，使用CCK-8试剂盒测定细胞活力。使用酶标仪在450 nm处测量吸光度（n＝6）。

1.6.2 细胞毒性检测 将MC3T3-E1接种在膜表面，孵育3 d后，用活／死细胞染色试剂盒进行染色，并使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。

1.6.3 细胞黏附观察 将MC3T3-E1接种在膜表面，孵育3 d后取出样品，用PBS溶液清洗后固定、梯度脱水，使用SEM进行观察。

1.7 体外促成骨性能检测

1.7.1 碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红（ARS）染色

将MC3T3-E1接种在膜表面并成骨诱导7 d后，使用ALP染色试剂盒进行ALP染色。同时，使用ALP检测试剂盒进行ALP活性定量检测，在405 nm处测量吸光度。成骨诱导21 d后，使用茜素红S溶液进行ARS染色。观察钙结节后，用10%氯化十六烷基吡啶溶解钙结节，并在560 nm处测量吸光度（n＝3）。

1.7.2 实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR） RT-qPCR用于分析成骨相关基因的表达，包括Runx-2、Col-1和OPN。将MC3T3-E1接种在膜表面并成骨诱导7 d后，使用Trizol试剂提取RNA，并使用SPARK-scriptⅡRT Plus试剂盒进行反转录。使用SYBR Green qPCR Mix在ABI Prism 7500系统上进行RT-qPCR。小鼠GAPDH、Runx-2、OPN和Col-1的引物序列见表1。使用2－ΔΔCT方法计算目的基因相对于对照组的倍数变化（n＝3）。

1.8 统计学分析

数据以珋x±s表示。使用GraphPad Prism 8软件（GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）通过单因素方差分析及SNK-q检验对各组进行比较。P＜0.05具有统计学意义。

表1 用于RT-qPCR的引物序列Tab 1 Primer sequences used for RT-qPCR

2 结 果

2.1 MNP／PCL复合膜的制备及表面形貌表征

所有组别均可成功完成材料打印。SEM图像显示PCL组打印丝粗细均匀，直径约为250μm，呈现出形状规则的孔隙，兼具较大的方形孔（直径约400 μm）和较小的三角形孔（直径约150μm），内部为互相交通的网格状结构，微观结构与打印前的模型设计基本相符（图2）。但MNP／PCL复合材料的打印难度增加，打印丝径均匀度差，丝径在100～500μm之间，内部孔隙不规则，与预先设计的模型不符（图2A～B）。优化打印参数后，5% MNP／PCL组和10% MNP／PCL组可以完成高精度打印，达到预先设计的效果。然而当添加比例达到15%时，易堵塞打印喷头，材料无法打印，故筛选PCL组，5% MNP／PCL组，10% MNP／PCL组进行后续实验。

图2 MNP／PCL复合膜的微观形貌Fig 2 Micromorphology of MNP／PCL compositemembranes

2.2 MNP／PCL复合膜的力学性能表征

MNP／PCL复合膜的屈服强度［5% MNP／PCL：（0.824±0.047）MPa；10% MNP／PCL：（0.883±0.026）MPa］和杨氏模量［5% MNP／PCL：（23.73±3.39）MPa；10%MNP／PCL：（29.26±0.88）MPa］显著高于PCL膜，表明MNP的添加提高了PCL的机械强度（P＜0.01）。但同时也显著降低了PCL的最大应变（5% MNP／PCL：22.88%±1.84%；10% MNP／PCL：14.37%±0.59%）（P＜0.05）（图3A～B）。

2.3 亲水性检测

PCL组的水接触角（110.27°±2.05°）显著高于5%MNP／PCL组（87.63°±1.45°）和10% MNP／PCL组（68.00°±1.53°），这表明MNP的添加提高了PCL的亲水性（P＜0.001）（图3C）。

图3 MNP／PCL复合膜的力学性能及亲水性表征Fig 3 Mechanical properties characterization and hydrophilicity of MNP／PCL compositemembranes

2.4 MNP／PCL复合膜的生物相容性评价

CCK-8分析结果表明，相较于空白对照组和纯PCL组，MNP／PCL复合膜表现出明显的促进细胞增殖的效果（P＜0.001）（图4A）。活／死染色染色的结果显示，所有膜的表面主要是活细胞，而死细胞很少，证明材料不具备明显的细胞毒性（图4B）。SEM图像显示，细胞在PCL表面多呈球形，但在5%MNP／PCL和10%MNP／PCL表面则伸展更为充分，可见大量丝状伪足及片状伪足，这提示其具有更高的细胞黏附性（图4C）。同时，活／死染色染色及SEM结果均显示，5%MNP／PCL和10% MNP／PCL表面细胞数量显著多于PCL膜，再次证明其具有促细胞黏附特性。

2.5 MNP／PCL复合膜的体外促成骨性能评价

ALP染色结果显示，相较于PCL组，MNP／PCL膜表面紫色染色面积更大，颜色更浓，表明其上的细胞具有更高的ALP活性（图5A）。ALP活性检测结果与ALP染色结果一致（P＜0.01）（图5B）。同时，10%MNP／PCL的ALP活性略高于5%MNP／PCL。ARS染色图像显示含有MNP的膜表面红色钙结节显著增加（图5C）。ARS染色的半定量测量结果与ARS染色一致（P＜0.001）（图5D）。通过qPCR分析发现：7 d后与空白对照组和PCL组相比，MC3T3-E1接种于MNP／PCL后表现出以下基因的高水平表达（图5E）：5%MNP／PCL组和10%MNP／PCL组的OPN基因相对表达量分别约为1.88倍和2.56倍；Col-1基因相对表达量分别约为2.67倍和2.94倍；Runx-2基因相对表达量分别约为1.88倍和1.96倍。上述实验结果表明，MNP／PCL复合膜表现出了显著的促成骨能力（P＜0.05）。

3 讨 论

GBR支撑性膜除了具有良好的空间支撑能力之外，还应尽可能减小其自身重量以减轻其对骨组织的压迫，同时也应该尽可能减小其厚度以避免其自身占据过多的成骨修复空间和造成过大的组织张力。足够的机械强度是拥有稳定空间支撑性的前提。本研究选择了一种45°／135°／0°／90°的充填结构，相较于经典的0°／90°／0°／90°充填结构，该种充填结构可以在同等打印丝直径、打印间距和打印尺寸下形成更小的孔径，且具有更优秀的力学性能［14］，更符合GBR膜的应用要求。

本研究使用磷酸镁铵作为功能性添加物形成了MNP／PCL复合材料，用以改善PCL生物相容性和促成骨潜能不佳的缺陷。在本研究中，亲水性测试的结果表明，MNP显著提高了PCL的亲水性，且与MNP的的释放速率及释放量仍需要更深入的研究加以探索。同时，PCL作为一种可降解的生物材料，其在添加MNP后对其降解速率的影响也有待更进一步的研究。更加重要的是，作为GBR膜另一至关重要的功能，MNP／PCL复合GBR膜的促成骨潜能仍有待通过体内动物实验进行更深入的探索。

图4 MNP／PCL复合膜的生物相容性评价Fig 4 Biocompatibility evaluation of MNP／PCL compositemembrane

图5 MNP／PCL复合膜的促成骨能力评价Fig 5 Evaluation of bone-promoting ability of MNP／PCL compositemembrane

MNP／PCL混合材料对3D打印的工艺提出了更高的要求。相较于纯PCL，熔融状态下的MNP／PCL混合物流动性下降，黏性上升，无法使用PCL组的参数进行打印。提升熔融温度至90℃以提高混合材料流动性使其可以顺利挤出，但过高的材料流动性会导致材料挤出过多，且更高的温度会导致材料挤出后凝固时间延长，材料流动扩散更为明显，造成打印丝直径明显高于设定直径，且过高的挤出量会导致打印成品厚度和重量的上升（图2A）。提高喷头移动速度至10 mm／s可以减少单位时间内挤出到同一位点的材料量，但过高的速度会导致打印丝拉伸变细甚至中断，孔隙增宽，打印精度也随之下降（图2B）。最终，经过反复调节参数，通过适当提高熔融温度以提高混合材料流动性，降低打印平台温度加速熔融材料凝固以减少材料的流动扩散，下调挤出速度百分比和提高打印速度以保证打印丝的均匀度，实现了5% MNP／PCL和10%MNP／PCL膜的高精度打印（表2）。但是15%MNP／PCL因为添加比例过高，极易造成喷头堵塞，提高熔融温度至100℃仍然无法顺利挤出，又因MNP在100℃以上易分解［17］，故现有条件下无法完成15%MNP／PCL组的材料打印。如何实现高添加比例MNP／PCL混合材料的3D打印仍需进一步的探索。

4 结 论

本研究从目前临床阶段GBR所面临的难点出发，开发出了一种兼具生物降解性和机械性能的GBR支撑性膜。本研究选择了力学性能更强的45°／135°／0°／90°充填结构，并经过打印工艺的优化，成功实现了MNP／PCL复合材料的打印。随后通过体外细胞实验证明MNP／PCL复合膜具有优异的生物相容性和促成骨能力。综上，本研究为3D打印可降解支撑性GBR膜的研发提供了可行方案，但未来仍需大量体内研究以实现最终临床效果。

表2 3D打印参数Tab 2 Parameters of 3D printing