仙人掌果多糖保护胰岛β细胞免受氧化应激诱导的凋亡机制研究

储芳馨, 陈寒青

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

糖尿病作为一种以高血糖为特征的慢性代谢综合症,严重影响患者的身心健康,是全人类共同面对的巨大威胁[1]。氧化应激是糖尿病发生发展的重要因素,长期的氧化应激状态会导致胰岛β细胞凋亡和胰岛素分泌不足,从而无法正常调节血糖[2]。因此,通过减轻氧化应激状态下的胰岛β细胞凋亡来改善糖尿病症状可能是一种有效的策略。

植物多糖是植物细胞代谢产生的聚合度超过10的聚糖,广泛存在于植物中,通常具有高活性、低毒性的特点[3]。植物多糖已被证实具有抗氧化、抗疲劳、抗过敏、抗肿瘤、抗炎、免疫调节、降血糖等多种生理活性,有望在保健食品的研发领域发挥巨大优势[4-6]。

仙人掌果(OpuntiadilleniiHaw.fruit)是仙人掌属植物的果实,仙人掌果的果肉中含有丰富的微量元素、蛋白质、氨基酸、维生素、多糖类、黄酮类和果胶等物质,营养价值丰富[7]。从仙人掌果中分离纯化的多糖已被证实具有抗肿瘤、降血压、降血糖、抗氧化、抑制菌生长和调节免疫等多种生理活性[8-14]。然而目前对于仙人掌果多糖(OFPPs)抗胰岛β细胞凋亡的作用及其机制的研究很少。

网络药理学是基于网络的构建、分析和验证来揭示生物活性成分在分子水平上的作用机理,从整体角度研究活性成分与疾病的关系,突出活性成分、靶点和疾病相互作用的整体性和系统性。网络药理学的应用广泛,目前已经在药理学研究、复杂性疾病机制的揭示和药物的发现、中医药研究和新药创制上取得了显著进展。网络药理学与体内外实验相结合,对于验证活性成分的效果并分析其机制具有巨大的优势[15]。

因此,本文通过网络药理学预测仙人掌果多糖对胰岛β细胞氧化应激损伤的保护作用机制,分析凋亡在其中起到的作用,并通过体外实验进行验证,为仙人掌果多糖作为功能性食品应用于改善糖尿病症状提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3种OFPPs组分由本课题组前期提取分离并进行单糖组成分析;大鼠胰岛素瘤(INS-1)细胞购于中国医学科学院基础医学研究所;3% H2O2溶液、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)购于美国Sigma-Aldrich公司;B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 OFPPs的分离纯化

仙人掌鲜果洗净、脱皮、去籽后,将果肉打浆,在常温下加入0.1 mol/L NaOH溶液,其与果浆的体积比为4∶1,并搅拌提取3 h,将提取液过100目筛,3 500 r/min离心10 min获得上清液。使用旋转蒸发仪将上清液浓缩至原体积的1/4左右,边搅拌边加入无水乙醇并调节最终乙醇体积分数为20%,4 ℃静置过夜后3 500 r/min离心10 min获得20%乙醇沉淀的粗多糖组分,然后向上清液中继续加入无水乙醇使其最终体积分数为30%和40%,重复静置、离心过程获得30%乙醇和40%乙醇沉淀的粗多糖组分。将3种粗多糖组分经AB-8大孔吸附树脂脱色,再通过Sevag法脱蛋白、透析、冻干后,得到经过初步纯化的仙人掌果3种粗多糖组分,分别命名为F1、F2、F3。

将3种粗多糖组分完全溶解于超纯水后,离心获得上清液,分别通过DEAE-纤维素-52离子交换色谱柱进行纯化,依次用蒸馏水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液梯度洗脱,收集洗脱液中的主要组分,浓缩、透析、冻干,再将其重新溶解和离心,上清液分别通过Sephacryl S-400 HR葡聚糖凝胶柱进一步纯化,使用超纯水洗脱,收集超纯水洗脱的主要多糖组分,浓缩、透析、冻干,得到分离纯化的3种均一的仙人掌果多糖组分,分别将其命名为OFPP-1、OFPP-2、OFPP-3。将3种多糖组分分别溶于超纯水(质量浓度为1 mg/mL)制备成多糖水溶液进行后续实验。

对分离纯化获得的OFPPs进行单糖组成分析,OFPP-1由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖组成,5种单糖摩尔比为2.42∶1.00∶1.08∶0.26∶0.39,分子量为803.7 kDa;OFPP-2和OFPP-3由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖组成,3种单糖的摩尔比分别为11.73∶1.00∶2.35、1.09∶1.00∶0.30,分子量分别为555.1、414.5 kDa。

1.3 OFPPs的“成分靶点”网络分析

运用Pubchem数据库获得各单糖组分的简化分子线性输入系统表达式,并导入到结构相似度预测靶点数据库SwissTargetPrediction预测其有效靶点。根据生物活性成分,制作“network”和Type文件,并将其导入Cytoscape 3.9.2软件进行网络拓扑学分析,根据基因的连接数量(Degree值)调整靶点的图形、颜色、透明度和大小,构造“成分-靶点”网络图。

1.4 氧化应激及糖尿病相关靶点预测

将关键词“Oxidative Stress”与“Diabetes”输入GeneCards数据库进行检索,出现疾病相关的基因,下载相关信息得到疾病对应的Gene Symbol信息,保留“Gene Symbol”“Description”和“Category” 3列数据进行初步筛选;再将关键词输入在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)数据库进行再次检索和筛选,下载相关信息,并与初步筛选的基因进行归纳,提出重复基因,合并后即为本文所研究的疾病靶点。

1.5 交集靶点的获取

通过Venny软件获取活性成分作用的靶点与疾病的交集靶点,作为仙人掌果多糖减轻氧化应激、改善糖尿病症状的潜在关键靶点。

1.6 蛋白相互作用网络构建及网络拓扑分析

通过String平台导入交集基因,设置对象为homo sapiens、取最高置信度0.900,隐藏游离基因节点,得到蛋白互作关系;结果导入Cytoscape 3.9.2软件中,选择“network analyzer”,得到网络拓扑学参数;然后把下载的TSV文件导入Cytoscape软件绘制蛋白相互作用图,根据Degree值筛选前十的核心靶点。

1.7 GO和KEGG富集分析

利用生物信息学开源软件Bioconductor在R软件内安装运行clusterProfiler、Stringin和Pathview程序包,对其进行生物学过程的基因本体(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encylopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析,并通过微生信平台进行可视化显示。GO分析从生物过程探究针对疾病的作用靶蛋白在基因功能中的作用;KEGG分析主要为通路分析,目的为阐明活性成分针对疾病的主要信号通路。

1.8 实时荧光定量PCR

将传代后重悬的INS-1细胞接种到6孔板中培养3 d,分别使用含有12.5、25.0、50.0 μg/mL OFPPs(分别定义为L、M、H组)与50 μg/mL NAC的完全培养基培养细胞24 h,弃上清液,添加完全培养基稀释的500 μmol/L H2O2,在培养箱中孵育1 h。使用Trizol法提取细胞RNA。使用RNA浓度检测仪测定浓度,并根据所需体系计算出反转cDNA需要的上样量,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪进行逆转录。反应结束后各管加入50 μL的无菌蒸馏水,涡旋混匀得到cDNA溶液。构建反应体系放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增,检测Bcl-2、Bax、Caspase3的mRNA表达水平。

1.9 数据分析

实验数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析,并以(平均值±标准差)的形式表示,组间差异比较采用单因素方差分析。与对照组相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01;与H2O2组相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01。

2 结果与分析

2.1 活性成分与作用靶点的预测结果

在本课题组前期实验中,对OFPPs的单糖组成进行了分析,其中的主要活性成分为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖。根据SwissTargetPrediction的预测结果,有效靶点为82个,具体如图1所示。

图1 仙人掌果多糖活性成分靶点预测

2.2 氧化应激及糖尿病潜在靶点的筛选结果

通过关键词“Oxidative Stress”和“Diabetes”在GeneCards和OMIM筛选疾病Score较高的靶点,搜寻到“氧化应激”相关的靶点10 051个,“糖尿病”相关的靶点14 895个,剔除掉重复靶点并合并疾病的交集靶点后,共有6 623个潜在靶点。

2.3 靶蛋白与交集蛋白的筛选

利用Venny在线网站,将OFPPs活性成分的作用靶点与氧化应激、糖尿病的相关靶点进行归纳与筛选,如图2所示,OFPPs和氧化应激、糖尿病共有70个相关作用靶点,约占总集合的1.1%。

图2 OFPPs与氧化应激、糖尿病的共同靶点韦恩图

2.4 核心靶点的蛋白相互作用网络构建

将OFPPs和氧化应激、糖尿病的交集蛋白导入String数据库并导入Cytoscape软件,得到蛋白相互作用网络图,如图3所示。

图3 潜在作用靶点的蛋白相互作用网络关系

图3中最中心的圆就是筛选出的核心基因,其中前十的核心靶点分别为CASP3、VEGFA、STAT3、IL2、HSP90AA1、SLC6A2、KDR、BCL2L1、PRKCA和FGF2,其中CASP3在细胞凋亡中发挥了重要作用。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

将70个交集蛋白导入Bioconductor软件进行GO富集和KEGG通路分析。GO功能富集分析的结果如图4所示。

图4 交集蛋白的GO功能富集分析

其中OFPPs参与减轻糖尿病中的氧化应激所涉及到的1～10号生物过程分别为G蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、肾上腺素能受体信号通路、平滑肌收缩、药物反应、循环系统中的血管过程、血管收缩、血管直径负调节、管径调节、调节血管直径等生物过程。

KEGG通路分析结果如图5所示。

图5 交集蛋白的KEGG通路分析

图5中,获取的评分较高的1～23号信号通路分别为神经活性配体-受体相互作用、TRP通道的炎症介质调节、钙信号通路、细胞间隙连接、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、含血清素的神经突触、血管平滑肌收缩、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、胰岛素抵抗和癌症中的蛋白聚糖、化学致癌受体激活、生长激素的合成分泌及作用、淀粉和蔗糖代谢、氮代谢、VEGF信号通路、Rap1信号通路、cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、NF-κB信号通路、细胞凋亡相关通路。

2.6 OFPPs对信号通路的影响

通过实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase3的mRNA表达水平,结果如图6所示。由图6可知,在H2O2的诱导下,INS-1细胞内Bcl-2、Caspase3的mRNA表达水平显著提高,而Bax的mRNA表达水平显著下降,证明氧化应激状态促进了胰岛β细胞的凋亡,影响了机体对血糖的调节。但在NAC和OFPPs的处理下,Bcl-2、Caspase3的mRNA表达水平不同程度地降低,而Bax的mRNA表达水平不同程度地提高,证明了OFPPs可以抑制氧化应激状态下胰岛β细胞的凋亡。

图6 OFPPs对INS-1细胞凋亡相关因子mRNA表达的影响

氧化应激与多种凋亡信号通路有关,氧化应激状态下产生的活性氧可以激活细胞凋亡信号从而促进胰岛β细胞的凋亡,其中Caspase家族和Bcl-2家族是最常见的调控因子[16-17]。Bcl-2家族由抗凋亡和促凋亡成员组成,调节线粒体凋亡途径,其中Bcl-2是一种抗凋亡的线粒体膜蛋白,而Bax是一种促凋亡蛋白,Bcl-2与Bax蛋白表达比率的降低驱动凋亡因子释放到细胞质基质中,促进Caspase3的激活,从而启动线粒体凋亡[18]。一些研究[19-20]表明,下调细胞内Bax/Bcl-2及Caspase3的水平可以有效抑制细胞凋亡。

实验结果表明,3种OFPPs组分均可以不同程度地减轻氧化应激状态下胰岛β细胞的凋亡,其效果的差异可能与多糖不同的结构(如分子量、糖残基和链构象等)有关,需要进一步研究[21]。

3 结 论

本文通过网络药理学预测OFPPs减轻糖尿病中氧化应激的潜在可能与机制,对OFPPs及“糖尿病氧化应激”的作用靶点进行整合,其中部分核心蛋白与凋亡相关,且其机制同样涉及到细胞凋亡信号通路。通过细胞实验证明,OFPPs可以降低Bcl-2、Caspase3的mRNA表达水平,提高Bax的mRNA表达水平,抑制凋亡通路的激活。因此,OFPPs具有通过减轻胰岛β细胞凋亡从而改善糖尿病症状的潜力,但其作用仍需进一步体内外实验验证。