特应性皮炎和类风湿性关节炎:两样本双向孟德尔随机化研究

魏明镜,邵钲超,万昊悦,王奕恒,陈文琦

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种常见的慢性炎症性皮肤病,AD患者常伴剧烈瘙痒,严重影响生活质量[1-2]。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种全身性自身免疫性疾病,以慢性滑膜炎症为特征,全球发病率为0.5%～1%[3]。RA主要影响关节,导致软骨破坏、骨损伤和全身合并症[4]。目前关于AD和RA之间关系的横断面研究、病例对照研究、队列研究、Meta分析研究,大多表明AD患者的RA患病率显著升高,AD是RA发生的危险因素[5-11];另一些研究表明,RA患者发生AD的概率降低[12-13]。

此矛盾结果的出现可能是由于一些研究采用问卷法来评估特应性疾病[5,12-13],而其他研究[6,10]的数据来自全国数据库。与孟德尔随机化(mendelian randomization,MR)研究相比,这些研究有其自身的缺点。病例对照研究未能解释时间顺序模糊的因果关系;观察性研究的结果受到多种干扰因素的影响,且无法揭示终生暴露于RA与AD风险的关联;队列研究通常需要长时间的随访,研究对象很难保持合规性,且队列研究开始时暴露已被严格定义;Meta分析在文献查找、选择、数据提取和统计分析过程中,如果处理不当,会引入新的偏倚。

MR是一种更可靠的因果推理方法,可以克服观察性研究的局限性[14]。MR分析使用单核苷酸多样性(single nucleotidepolymorphisms,SNPs)作为遗传工具来估计相关暴露对结局的影响[15]。近年来,MR被广泛用作评估暴露与结局之间因果关系的替代方法[16]。MR可以被认为是一种自然的随机化临床试验(randomized clinical trial,RCT)。与RCT的一般设计相比,MR的最大优势在于作为危险因素工具的SNPs是随机分配的,避免了潜在混杂因素或反向因果关系的影响[17]。

1 方法与资料

1.1研究设计 本研究先将RA作为暴露因素,以与RA显著相关的SNPs作为工具变量,AD则作为结局变量。使用两样本MR分析的方法进行正向MR分析,利用 CochranQ检验进行异质性检验,最后对所得结果进行敏感性分析以验证其可靠性。然后再将AD作为暴露因素,与AD显著相关的SNPs作为工具变量,RA作为结局变量,进行反向的两样本MR分析,最后得出结论。

1.2资料来源 通过GWAS数据库(https://gwas.mrcieu.ac.uk)获得关于RA和AD的遗传数据。RA的遗传数据来自于Okada等[18]的研究数据,包括来自22项欧洲人群研究的14 361例RA和43 923例对照。AD的遗传数据来自EAGLE湿疹联盟进行的最大的GWASmeta分析,该分析得出了与AD的遗传关联,共21 399例AD和19 436例对照[19]。所有使用的数据都已在公共领域,无需额外的伦理批准。研究人群的遗传背景均来自欧洲血统,以避免因种族相关混杂因素造成的偏差。基本信息见表 1。

表1 两样本MR研究中GWAS数据库的基本信息

1.3SNPs的选择 选择汇集与RA和AD有显著意义(P<5.0×10-8,F>10)的SNPs,再设置r2的阈值为0.001,千碱基对(kb)为10 000以聚集SNPs。当r2>0.001,kb<10 000时,SNPs从当前分析中删除,确保没有连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)相关性。异质性检验剔除显著异质性SNPs,最后得到与RA和AD显著相关的有效SNPs作为工具变量。

1.4孟德尔随机化分析 在协调RA和AD的GWAS的效应等位基因后,使用了几种MR方法来确定AD和RA的MR估计值,即逆方差加权(inverse variance-weighted,IVW)、MR-Egger回归法、加权中位数法(weighted median, WME)[20]。研究表明,多效性和异质性分析均为阴性时,IVW分析是MR中最准确的方法[21]。MR-Egger考虑到截距的存在,用其来评估多效性。WME假设一半工具变量有效,分析暴露与结局之间的因果关联。所有分析均使用Rversion 4.1.2中的“TwoSampleMR”包进行分析。

1.5敏感性分析 敏感性分析在 MR 研究中对于检测潜在的多效性至关重要,本研究进行了包括留一法(Leave-one-out)、MR-Egger 和MR-PRESSO方法在内的灵敏度分析。CochranQ检验P>0.05时被认为表明异质性较低,表明工作变量之间的估计值随机变化,缺乏水平多效性,但对IVW结果影响不大[22]。从MR-Egger回归获得的截距是方向多效性的指标(P<0.05被认为是存在方向多效性)[23]。MR-PRESSO分析可以检测潜在的外围SNPs,在排除异常值后提供调整结果,以此校正水平多效性。留一法主要是依次剔除每个SNPs,然后计算剩下所有SNPs的结果,通过该种方法来确定单个SNPs的影响是否不成比例地影响了关联[24]。

2 结果

2.1RA对AD的因果效应及敏感性分析 RA数据集中总共鉴定出56个与RA相关的SNPs,具有全基因组显著阈值(P<5×10-8)。留一分析表明,rs6679677、rs12126142与其他SNPs扮演着矛盾的角色(图1)。同时去除以下具有中等等位基因频率的回文SNPs:rs13330176、rs168962、rs74956615、rs909685。去除后,使用IVW分析(O=1.043,95%CI:0.959～1.134,P=0.328)未发现RA对AD的因果影响的重要证据。同时,使用MR-Egger回归(OR=1.254,95%CI:0.879～1.790,P=0.219)和WME(OR=1.058,95%CI:0.971～1.153,P=0.195)获得了类似的风险估计(图2)。

图1 留一法敏感性分析结果

图2 RA对AD的MR 分析结果图

经 CochranQ检验表明,IVW(P=2.56×10-7)和MR-Egger回归(P=1.72×10-7)存在异质性。尽管存在异质性,但不影响IVW结果。MR-PRESSO也给出了类似的结果(全球异质性检验中的P<0.001)。多效性检验结果表明,MR-Egger回归的截距为-0.02,P=0.301,表明不存在潜在的水平多效性。

2.2AD对RA的因果效应及敏感性分析 AD该数据集中鉴定了12个与AD相关具有全基因组显著阈值(P<5×10-8)的SNPs,去除了以下具有中等等位基因频率的回文SNPs:rs10790275。留一分析表明,依次剔除各 SNPs后,剩余的 10个SNPs的IVW分析结果与纳入全部 SNPs 的分析结果相近,未发现对因果关联估计值影响较大的SNPs(图3)。使用IVW分析,没有发现AD对RA的因果影响的重要证据(OR=1.026,95%CI:0.903～1.166,P=0.691)。同时,使用MR-Egger回归(OR=0.913,95%CI:0.497～1.676,P=0.776)和WME(OR=1.000,95%CI:0.908～1.102,P=1.000)获得了类似的风险估计(图4)。

图3 留一法敏感性分析结果

图4 AD对RA的MR 分析结果图

CochranQ检验表明IVW(P=6.88×10-5)和MR-Egger回归(P=4.05×10-5)存在异质性。尽管存在异质性,但不影响IVW结果。MR-PRESSO也给出了类似的结果(全球异质性检验中的P<0.001)。多效性检验结果表明,MR-Egger回归的截距为0.017,P=0.708,表明不存在潜在的水平多效性。

3 讨论

本次研究运用MR评估AD与RA发病风险之间的因果关系,没有明确的证据支持RA增加AD的发病风险,也没有明确的证据支持AD增加RA的发病风险。

近年来,关于AD和RA之间的联系一直存在争议,一部分研究证明AD患者患RA的风险增加。一项德国的大规模队列研究发现,40岁或以下的AD患者发生RA的风险增加[10]。Narla等[7]针对美国成人和儿童的横断面研究中证明 AD患者患RA的风险显著增加,Rittiphairoj等[11]进行的Meta分析证明AD 患者的 RA 发生风险显著高于健康者,最新的两项病例对照研究也得出了同样的结论[5-6]。另一部分实验研究表明,RA患者患AD的概率降低[12-13],RA可能在某种程度上对AD的发展提供一定程度的保护作用。Hilliquin等[12]调查了173例RA患者,与对照组相比患者的特应性患病率较低,且疾病的严重程度也较低,另一项德国的横断面研究也得出类似的结论[13]。

RA和AD的发生都受到遗传因素的强烈影响,都表现出慢性复发缓解的模式,这两种疾病可能共享一些遗传机制和生物过程。一些关键因子如IgE、TSLP、IL-33和IL-17在AD和RA的发展中都扮演着重要的角色[25]。Millauer等[26]测量了RA患者中IgE-抗IgE复合物的水平,发现其明显升高,表明RA患者中存在抗IgE抗体,可能与IgE结合形成复合物,从而防止嗜碱性粒细胞和肥大细胞致敏,降低AD的发病率。IL-17在AD和RA的发生中均起重要作用,促进自身免疫的Th17反应有助于RA的慢性发展[27]。IL-17也在AD患者的外周Th17细胞中被发现,且在AD的复发-缓解过程中发挥作用[28],这表明AD患者患RA的概率增高可能与持续的皮肤炎症伴随的Th1/Th17信号传导增加和促炎细胞因子的分泌有关。IL-33在RA患者的滑膜组织和AD患者的角质形成细胞中都过表达且在这两种疾病发展中都发挥重要作用[29-30],进一步强化了这两种疾病之间的联系。TSLP在AD的发生发展中扮演着关键角色,最新研究表明, RA患者滑液中TSLP浓度升高且加重RA的症状[31-32]。

传统观察性研究可能受到潜在混杂因素和反向因果关系的偏见,而MR研究可以在观察环境中模拟随机对照试验,并且有效避免在受孕时随机分配的SNPs的混淆偏倚。然而,MR研究也有局限性。首先,遗传工具的功能以及它们如何影响风险因素尚不完全清楚。其次,MR研究仍然无法消除可能被少量遗传仪器或小样本量掩盖的潜在多效性效应,尽管MR-Egger截距几乎没有水平多效性。本研究中CochranQ检验存在异质性,因此进行了留一分析,显示了观察到的关联的稳定性。

AD是一种高度异质性疾病,不同个体之间的差异非常大,可根据AD患者的临床表现、皮肤屏障状态、血清IgE水平以及种族等分为不同的亚型[33]。本研究中的GWAS数据都来自欧洲,研究证明AD在欧美成年人中的患病率较亚洲成年人要高得多,且亚洲AD患者的病变和非病变皮肤中IL-17较欧美AD患者更高[34],因此亚洲AD患者较欧美AD患者更有可能患RA,IL-17水平可作为预测AD患者合并RA的生物标志物。AD还可根据IgE的含量分为内源性和外源性[35],研究证明内源性AD与RA的关系更密切[27]。未来应注意AD患者之间的多样性并进行AD亚组的更大规模的研究。

总之,本研究表明AD和RA之间没有因果关系。明确AD和RA的病因对其诊断和开展有针对性的个体化预防和治疗具有重要意义。