含骨形态发生蛋白-2的骨修复水凝胶的研究进展

李芷仪，仉建国，王升儒

骨骼是人体重要的组成部分，承载了保护、运动、代谢等重要生理功能。外伤或某些疾病可能会造成骨缺损，影响骨的正常生理功能。对于较小的骨缺损，机体可以通过骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells, BMMSCs）分化、成骨细胞活性增加等方式进行膜内成骨及软骨骨化，从而完成骨修复。但如果骨缺损较大，并达到了骨修复的临界大小，仅依靠机体自身的骨再生能力很难达到预期效果，因此需要额外的骨修复材料。此外，对于需要进行骨融合术（如关节融合术或者脊柱融合术）的患者，若目标关节或者脊柱不能在一定时间内达到骨融合，内固定物将受到过大的应力载荷而面临内固定失败的风险。在上述情况下，多需要使用促骨修复材料以达到更好的骨修复效果。

临床上现有的骨修复材料的“金标准”为自体骨移植，多选用髂骨或肋骨。自体骨移植因取材量受限，并给患者带来二次创伤[1]，临床应用受限。其他的骨修复材料包括同种异体骨、异种骨及人工合成骨：同种异体骨主要来源于尸体骨，虽然避免了移植物部位疼痛、伤口不愈合等并发症问题，但其来源较为有限，促骨修复效应也较差，并存在排异、感染等风险；异种骨主要为去细胞去蛋白的小牛骨，但其促骨修复效应较差；人工合成骨主要包括生物陶瓷、磷酸钙/硫酸钙骨水泥等，但其脆性较大，促骨修复效应较差。此外，在临床应用中，骨移植物需要固定于移植部位，而上述4种骨修复材料均为块状或粉末状，常因周围血流冲刷而移位，降低骨修复效应，甚至导致异位骨化。为了解决上述问题，新型骨修复材料的研发具有重要的意义。骨形态发生蛋白（bone morphogenic protein, BMP）在骨修复过程中起重要作用，而某些种类的水凝胶具有高生物相容性、固定活性物质、填充骨缺损的优势，其作为活性因子载体具有一定的临床应用前景。目前，已有多项研究针对含BMP-2的骨修复水凝胶开展研发工作，本文将对其研究现状及存在的问题进行综述。

1 BMP-2在骨修复中的应用

BMP蛋白是转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）超家族中最大的亚类，共分为18类，在机体内参与不同的信号通路进行调节。其中，很多研究均已表明BMP-2具有很强的骨诱导能力[2]和促血管生成能力[3]，可以诱导BMMSCs向成骨细胞分化，并促进成骨细胞分化成熟，加速骨缺损等修复。

研究者已开发了用基因重组方法制备重组人BMP-2（recombinant human BMP-2, rhBMP-2）[4]。临床上也已有一些产品将BMP-2作为促骨修复的活性材料使用，例如美敦力公司2002年开发的INFUSE@骨移植物就是将rhBMP-2与可吸收的胶原蛋白海绵进行复合，在骨缺损原位释放BMP-2达到促骨修复效应，美国食品药品监督管理局已批准INFUSE@产品用于脊柱椎体融合、新鲜胫骨骨折、口腔颌面骨移植等领域。值得注意的是，局部BMP-2浓度过高可能会引发炎症反应、血肿、感染等并发症，且如果BMP-2到达除骨缺损的其他部位，也会造成异位骨化等并发症[5]。INFUSE@产品中，由于BMP-2与胶原蛋白海绵仅为物理吸附，植入后会在短时间内大量释放BMP-2，导致局部BMP-2浓度过高，可能引发炎症反应和异位骨化等并发症；此外，由于骨修复通常需要6个月左右的时间，短时间内释放大量活性物质，而后续骨缺损部位缺少活性物质刺激，成骨性能将极大降低；最后，由于胶原蛋白海绵容易受血流冲刷而移位，并且不能精准适配骨缺损部位形态，增加了临床中使用该骨修复材料的困难。因此，需要寻找一个更好的BMP-2载体，在固定BMP-2于骨缺损部位的同时减少因局部BMP-2浓度过高带来的副作用，以满足临床中对促骨修复材料的需求。

2 用于骨修复材料的水凝胶基质

近年来，水凝胶材料作为生物活性物质载体材料受到较大关注。它是一种主要由亲水高分子聚合物长链构成的3D网状结构材料，水含量很高，其结构与细胞外基质十分相似，因此具有很高的生物相容性能，并被证实具有很好的可降解性能和骨传导性能[6]。已有一些研究开始应用水凝胶骨修复材料，由于水凝胶是一种高生物相容性的载体材料，研究表明其不仅可以负载促骨生成药物或活性蛋白，还可以作为干细胞生长黏附基质。骨修复材料中常用水凝胶基质材料种类见表1。

表1 骨修复材料常用水凝胶基质种类

大多数原始天然水凝胶的生物相容性较高，具有很好的信号传导能力，其本身就有一定的促骨修复能力，但机械强度较差，降解过程与速率多不可控，需要通过氧化或复合等方法进行改性。透明质酸是较为常用的水凝胶基质材料之一，作为人体真皮结缔组织、关节液和牙髓等的组成部分之一，透明质酸维持了细胞外基质的黏弹性[24]。细胞外基质中的透明质酸通过与BMMSCs表面的CD44标记作用，促进了BMMSCs的迁移，能在一定程度上促进骨再生[25]。此外，透明质酸可以做成可注射水凝胶形态，能够较好填充于骨缺损部位进行修复[26]。人工水凝胶可通过人工合成或将多肽改性得到机械强度更高、降级速率可控且生物相容性相对降低的水凝胶基质。RADA16水凝胶由16个亲水或疏水氨基酸组成，具有较高的生物相容性和可降解性能，其降解过程不会引起炎症反应，因此已经被应用于神经修复、韧带修复、骨修复等多个领域[27]。此外，RADA16水凝胶的多肽结构可以通过生物化学反应将各种活性蛋白或生物因子锚定在RADA16水凝胶的C端[27]。

水凝胶作为BMP-2在体内原位释放的载体，可将BMP-2固定于骨缺损部位、填充骨缺损部位，并且可以制成可注射水凝胶载体注射到骨缺损部位并原位成型，可完美适配骨缺损部位不规则的形态，使活性物质BMP-2与松质骨表面紧密接触，诱导BMMSCs分化和成骨细胞活性功能最大化[28]。但选用上述单一水凝胶充当载体很难达到生物相容性和力学性质都优良的理想状态。因此，现有研究多集中于材料复合改善水凝胶基质的性能，包括将不同水凝胶进行复合以提升水凝胶的综合性能，或将水凝胶与其他硬材料支架进行结合，在提升支架生物相容性的同时弥补了水凝胶材料力学性能较差的天然劣势。例如海藻酸盐虽然具有弱细胞毒性、低成本、易于凝胶化、良好兼容性等优点，但其缺乏生物结合位点，使其负载活性物质的能力不足；而胶原蛋白的生物相容性高、细胞黏附性好，但机械性能稍差。有研究将海藻酸盐与胶原蛋白进行复合，综合二者优点，形成具有高生物相容性、低细胞毒性、可控力学性能的新型凝胶，负载BMP-2后形成的活性复合水凝胶可进行原位BMP-2释放，以达到促骨修复的作用；该研究还将活性复合水凝胶与可降解聚乳酸支架进行复合，形成活性复合支架，能够在骨修复尚未完成的早期为骨缺损部位提供力学支撑，保留缺损骨的力学支撑功能[14]。也有研究将含rhBMP-2和磷酸三钙（tricalcium phosphate, TCP）的去细胞化细胞外基质凝胶与可降解的聚己内酯硬材料支架进行复合，形成具有高促骨再生能力的支架，将有望应用于临床骨缺损修复。虽然使用水凝胶材料作为载体材料可以将BMP-2固定在骨缺损部位，但单纯物理混合仍然不能规避BMP-2因局部浓度过高可能导致的副作用[19]。

3 含BMP-2的骨修复水凝胶的常用添加物

为减少水凝胶中BMP-2的总量以规避局部浓度过高所带来的副作用，同时达到相近的促骨再生效应，常需要在水凝胶中加入其他促骨再生的物质。常用添加物见表2。

表2 含BMP-2的骨修复水凝胶的常用添加物

由于BMP-2释放时间较短，而骨修复至少需要6个月左右的时间，当骨修复材料中的BMP-2释放完的后续骨修复缺乏活性物质引导，因此考虑加入其他持续时间较长的促骨再生的物质，以补充BMP-2的骨修复能力，同时降低BMP-2的使用量。局部较高的钙浓度有助于促骨形成[37-38]，而且无机物通常不易被血液冲刷到别处，可有效提高局部组织钙浓度，可以在BMP-2释放完的后续较长时间内有效促进骨再生。双膦酸盐是抗骨吸收的一类新药，已有研究报道在骨缺损部位应用双膦酸盐可促进骨再生[39]。还有研究表明，氧化石墨烯可以诱导BMMSCs向成骨细胞分化[33]，具有一定的促骨再生能力。除增加其他促骨再生物质外，也有增加促血管再生物质（如去铁胺和VEGF）以保证骨缺损部位血供充足，进而提高促骨再生的速率。而SDF-1可以将BMMSCs和造血干细胞诱导至骨缺损部位[40]，再结合BMP-2的骨诱导能力，能够更好地发挥材料的促骨再生能力。

4 水凝胶控制BMP-2释放速率策略

在控制水凝胶基质中BMP-2释放速率方面，主要有两种策略：①通过物理/化学作用力将BMP-2与载体结合，包括化学键结合、物理吸附、微球（mineral-coated microspheres, MCMs）包裹；②基因工程改性法。

4.1 化学键结合

相关报道主要将BMP-2用化学键连接至水凝胶的高分子上，例如可以通过胶原蛋白连接域[41]、多巴胺[8]、BMP-2的N端转谷氨酰胺酶底物结构域[42]等结构进行连接，使BMP-2局部富集，以减少扩散至周围组织造成异位骨化，减少材料中整体BMP-2的含量。本方法可以使BMP-2的释放速度与水凝胶基质的降解速率呈正比，以降低BMP-2的释放速率，使促骨再生效应得以持续。除了直接将BMP-2连接到水凝胶基质上，也有研究将BMP-2连接在肝素[15]或通过肝素连接至碳酸钙微球表面，可以通过改变肝素含量对BMP-2的释放进行控制。

4.2 物理吸附

氧化石墨烯具有较大的比表面积和低生物毒性，可通过静电吸附、氢键、π-π堆叠等物理作用力吸附药物，已作为药物输送和功能生物材料的纳米载体被广泛报道[43]。有研究将氧化石墨烯作为BMP-2载体，实现BMP-2的可控释放，预计在植入材料后8周均有持续的促骨再生能力及抗炎能力[8,33]。

4.3 MCMs包裹

Gong等[31]使用肝素将BMP-2封装于碳酸钙MCMs上，并将其与纤维蛋白水凝胶进行混合。研究表明，此类新型水凝胶可局部控制BMP-2释放的速度，从而延长活性材料的促骨再生效应。Xu等[44]通过静电吸附作用将BMP-2锚定于负载无机盐的MCMs，并与壳聚糖-聚乙二醇水凝胶进行交联形成壳聚糖/聚乙二醇-负载矿物质的微球@BMP-2水凝胶（chitosan/polyethylene glycol-MCM@BMP-2 gel,CS/PEG-MCM@BMP-2 gel），由于MCMs具有较好的蛋白结合能力及可控降解性能，体外试验结果显示第75日的CS/PEG-MCM@BMP-2 gel仅释放30.5%±3.6%，可用于BMP-2的运送与局部缓释。

4.4 基因工程改性法

基因工程改性法主要指基于基因转移的基因工程。通过将BMP-2基因转移至细胞内，可获得BMP-2的持续释放、保证BMP-2的生物活性，同时可以减少BMP-2的初始负载量，从而规避可能的副作用[45]。Lin等[46]利用慢病毒在体外将BMP-2基因转染至人BMMSCs，并利用可见光投影立体光刻技术将其与水凝胶支架进行混合，可达到长时间（56 d）释放BMP-2，在体内/体外试验中表现出高效的促骨再生性能。

综上，含BMP-2的活性水凝胶材料还存在以下问题：①材料降解及BMP-2释放速率与骨再生速率不匹配；②材料促骨再生能力有限；③BMP-2因局部浓度过高或渗透到别的组织中可能导致的副作用；④BMP-2释放速率不能达到持续小剂量释放的理想状态。

5 小结与展望

BMP-2有很强的骨诱导能力和促血管生成能力，很适合作为促骨再生的活性物质。而水凝胶材料因其良好的生物相容性被广泛应用于生物材料基质中。本文总结了研究中常用的水凝胶基质种类，以及为降低BMP-2可能副作用的材料改性方法。

现有活性水凝胶机械强度差，无法承载应力，且控制BMP-2释放时间的能力仍需提升。除了文中提到的材料改性方法，结合其他领域材料制备加工方法，可以考虑用纳米材料对水凝胶进行改性。纳米材料比表面积大，具有较好的吸附性能，可采用纳米材料（如碳纳米管、石墨烯、MXene等）包覆BMP-2蛋白，实现BMP-2的可控释放。此外，可结合静电纺丝或3D打印等方法制备管状结构、内填水凝胶，结合外层材料的机械性能和活性水凝胶的促骨再生活性，有望更好地进行骨缺损修复。若提升相关材料性能，含BMP-2的骨修复水凝胶可用于椎间融合、棘突间融合、关节间融合、较大部位骨缺损、骨质疏松部位修复等，为骨缺损修复临床工作提供更优方法。

【利益冲突】所有作者均声明不存在利益冲突