清胰汤通过lncRNA-PVT1竞争性结合miR-146a靶向TRAF6参与重症胰腺炎发生发展的机制研究

赖纪英 卢涵婧 郭宗文 岳霖琳 刘 欣 刘晓峰

（赣南医学院第一附属医院重症医学科，江西 赣州 341000）

重症胰腺炎又称为出血坏死性胰腺炎，不仅能引起腹腔大出血、肠瘘，亦可引起多器官功能衰竭[1]。作为临床上常见的急腹症，死亡率能达到20.0%～40.0%，具有病情重、预后差等特点，为我国居民死亡的重要原因[2]。项红等[3]研究表明急性重症胰腺炎患者早期死亡高峰为1～2周左右，多数患者死于全身炎症反应引起的多器官功能障碍综合征。目前，急性重症胰腺炎的确切分子机制尚未阐明，既往研究显示肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）能促进急性重症胰腺炎所致的炎症反应。因此，以此为靶点开发急性胰腺炎的治疗药物，具有很大的临床价值。miR-146a是一种主要在免疫炎症反应中起调控作用的微小核糖核酸（microRNA-146a，miR-146a）。Eliana Rodríguez等[4]研究表明miR-146a能够下调靶基因TRAF6的表达，通过某些信号通路起到抑制炎症反应作用，从而抑制急性重症胰腺炎的病理过程。miR-146a能抑制靶基因TRAF6，且除了TRAF6外，尚存在一个未知的靶基因，对相关信号通路发挥抑制作用，miR-146a可能通过对TRF6与其他靶基因共同调节来调控相应的炎症信号通路。浆细胞瘤多样异位基因1（PVT1）是首个报道与肿瘤相关的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA），lncRNA PVT1是一个原癌“基因”。史玉洁等[5]研究表明：清胰汤用于急性重症胰腺炎患者中具有良好的效果，能下调lncRNA PVT1表达水平，促进miR-146a的表达，下调TRAF6的表达水平抑制炎症反应，延缓病情进展，为患者后续治疗奠定基础。在哮喘相关炎症中也证实了lncRNA PVT1通过靶向miR-423基因抑制炎症反应[6]。因此，本研究主要探讨清胰汤在重症胰腺炎患者抑制炎症反应的作用机制。

1 资料与方法

1.1 动物资料 购置SD大鼠50只，随机取10只设为空白对照组；剩余40只大鼠采用4%牛黄胆酸钠注射制备重症胰腺炎动物模型，建模成功后随机取10只为模型对照组；剩余30只大鼠分为清胰汤组、清胰汤+空载组（空白腺病毒转染的空白载体组简称空载组）和清胰汤+PVT1沉默组，每组各10只。50只SD大鼠，雌雄随机，体质量（200～220）g，平均（210.00±10.00）g。所选动物均购置于湖南农业大学动物实验部。将购置的大鼠于动物房7 d适应性喂养，安静环境饲养，室温（22±2）℃，12 h交替光照，自由饮水，适应性喂养一周。

1.2 仪器与设备 生物机能实验系统，型号：BL-420，购自于成都泰盟公司；电子分析天平，购自于德国赛多利斯公司；超低温冰箱，购自于中国海尔公司；酶标仪，购自于美国BioTek公司；37℃恒温箱，购自于上海实验仪器厂；石蜡包埋机，购自于湖北孝感亚光医用电子技术有限公司；光学显微镜，购自于日本Olympus公司；电泳装置，型号：DYCP-31BM，购自于北京市六一仪器厂；凝胶成像及分析系统，型号：LabWorks TM，购自于美国UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 建模方法 30只SD大鼠参与重症胰腺炎模型建立，建模前均常规禁食24 h，禁饮4 h，给予浓度为10.0%水合氯醛（0.3 ml/100g）腹腔内注射麻醉。常规进行腹部剪毛，络合碘消毒后，铺无菌孔巾。待上述操作完毕后，在上腹正中线作长为3 cm的手术切口，并将切口下皮肤与肌层分离，打通切口到颈背部皮下隧道，逐层分离后进入腹腔。肉眼直视下确定十二指肠及胰腺部位，采用1号针头在胰胆管两侧斜行穿刺进入十二指肠弓两层腹膜之间潜在的间隙。给予浓度为5%牛磺酸胆碱，每100 g体质量0.1 ml，于3～5 min内注射完毕，轻轻按摩约15 s，保证药物的均匀弥散，使得胰腺区弥漫性充血、膨胀。

1.3.2 慢病毒注射及处理方法

（1）慢病毒注射。携带shPVT1慢病毒（LVshPTV1，5×108TU/ml）及空载病毒（LV-Control，8×108TU/ml），购自于吉凯基因。于建模前2周，常规采用立体定位仪，采用微量加样器将慢病毒注入SD大鼠右侧结肠两个位点：位点1：A-P1.0 mm，M-L-2.0 mm，D-V-1.2 mm；位点2：A-P-3.0 mm，M-L-1.5 mm，D-V-1.2 mm，每个位点注射2.5 μL。控制慢病毒注射速度为0.5 μL/ml，拔针前原位停留5 min。

（2）大鼠处理方法。清胰汤组成：柴胡15 g、白芍15 g、黄芩10 g、木香10 g、黄连10 g，加水500 ml，瓦罐内文火熬制1h，滤渣，余液继续文火熬煮浓缩到85 ml，置入生大黄15 g后，冲入芒硝10 g，常规制备生药/溶液1∶1的成药制剂，使用前将其放置在5℃冰箱中，保存。利用慢病毒转染干扰lncRNA PVT1序列（LV-shPVT1）及空载（LV-control），分为清胰汤组、清胰汤+空载组和清胰汤+PVT1沉默组，每日用药1次，连续干预7 d[7-8]。

1.4 观察指标

（1）HE染色。各组大鼠干预7 d后，断颈方式处死，取胰腺组织，经石蜡包埋后制备4 μm切片，并完成HE染色[9]。

（2）炎症因子。各组大鼠干预7 d后，以断颈方式处死，取静脉血5 ml，采用酶联免疫吸附试验测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-1β（IL-1β）水平；采用实时荧光PCR法测定各组miR-146a水平。

（3）TRAF6及细胞凋亡相关基因表达。采用Western blot法测定各组TRAF6及细胞凋亡相关基因（包括β-actin、ki-67、Bax、caspase、Caspase-9）表达，采用BiO-R重症胰腺炎图像分析系统照相，并利用Quantity One v4.6.2软件分析[10]。

1.5 统计分析 采用SPSS 26.0软件处理，计数资料行χ2检验，采用n（%）表示；多组计量数据比较采用F检验，两组间计量资料行t检验，采用±s表示，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胰腺组织HE染色结果比较 HE染色结果表明，清胰汤组病理学改善显著，胰腺组织内炎症细胞浸润明显减轻；清胰汤+空载组和模型组胰腺组织内可见微血栓形成，且随着时间延长加重，炎症细胞浸润明显，伴有上皮细胞炎性浸润；而清胰汤+PVT1沉默组则介于清胰汤组和清胰汤+空载组之间，见图1。

图1 各组小鼠胰腺组织HE染色

2.2 各组炎症因子及miR-146a表达水平比较 清胰汤组TNF-α、IL-1β表达水平均低于清胰汤+空载组和清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05）；miR-146a表达水平高于清胰汤+空载组和清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05）。清胰汤+空载组TNF-α、IL-1β水平高于和清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05），miR-146a水平低于清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05）。见表1。

2.3 各组TRAF6及细胞凋亡相关基因表达比较 清胰汤组TRAF6表达水平低于清胰汤+空载组和清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05）；细胞凋亡相关基因β-actin、ki-67、Bax、caspase-3、Caspase-9表达水平低于清胰汤+空载组和清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05）；清胰汤+PVT1沉默组以上指标表达水平低于清胰汤+空载组（P＜0.05），见图2。

图2 各组TRAF6及细胞凋亡相关基因表达比较

3 讨论

重症急性胰腺炎起病急骤、病情凶险、合并症多、死亡率较高，且临床治疗复杂、住院时间长，医疗费用较高，增加家庭及社会负担[11]。Wang C等[12]研究表明：重症急性胰腺炎患者常伴有胃肠动力障碍，增加麻痹性肠梗阻、腹腔间隔室综合征及肠道菌群移位等并发症发生率。但是，临床上对于重症急性胰腺炎患者的分子机制尚未阐明。TRAF6能显著促进急性重症胰腺炎所致的炎症反应，以此为靶点开发急性重症胰腺炎的治疗药物据有很大的临床价值。本研究中，HE染色结果表明，清胰汤组病理学改善显著，胰腺组织内炎性细胞浸润减轻明显；清胰汤+空载组和模型组可见微血栓形成，且随着时间延长加重，炎性细胞浸润明显，伴有上皮细胞炎性浸润。本研究中，重症胰腺炎大鼠建模成功后，伴有病理学的改变，表现为炎性细胞的大量浸润。而清胰汤的使用，能改善重症急性胰腺炎大鼠症状，能降低机体内的炎症反应。分析原因清胰汤属于中医常用汤药，主要由柴胡、白芍、黄芩、木香、黄连等药物组成。方药中，柴胡具有解表退热、疏肝解郁功效；白芍能发挥敛阴止汗、柔肝止痛功效；黄芩具有清热燥湿、泻火解毒功效；木香能发挥疏理肝气、行气止痛作用；黄连具有清热燥湿、泻火解毒功效；诸药共奏，能促进胃肠蠕动，降低肠腔内压力，保护肠黏膜屏障，抑制菌群移位[13]。本研究中，清胰汤组TNF-α、IL-1β水平均低于清胰汤+空载组和清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05），而miR-146a水平高于其他组，这提示清胰汤能降低重症急性胰腺炎大鼠炎症反应。

本研究通过生物信息学软件Starbase V2.0筛选出与TRAF6存在结合位点的miR-146a，二者呈现明显负相关，在急性重症胰腺炎患者可通过提高miR-146a的表达，的靶向下调TRAF6，抑制炎症反应，抑制急性重症胰腺炎的病理进程。同时，通过生物信息软件Starbase V2.0分析筛选出能够在急性胰腺炎组织中高表达，且与miR-146a启动子3'-UTR区域存在明显结合位点的lncRNA PVT1。而清胰汤的使用能下调lncRNA PVT1的表达，上调miR-146a的表达水平，通过对TRAF6的抑制等多个通路抑制炎症反应，减缓急性重症胰腺炎的发生发展[14]。本研究中，清胰汤组TRAF6表达水平低于清胰汤+空载组和清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05）；细胞凋亡相关基因β-actin、ki-67、Bax、caspase、Caspase-9表达水平低于清胰汤+空载组和清胰汤+PVT1沉默组（P＜0.05），这提示清胰汤的使用能下调lncRNA PVT1表达，抑制细胞凋亡，延缓病情发展。明确相关的作用机制可为重症急性胰腺炎的治疗提供新的思路。

综上所述，在重症胰腺炎中，清胰汤能通显著下调lncRNA-PVT1表达，上调miR-146a的表达水平，通过靶向抑制TRAF6等相关通路，抑制炎症反应，抑制细胞凋亡，减缓重症胰腺炎的病理进展，改善患者预后。