基于AMPK/NLRP3 通路介导的细胞焦亡探究牡荆素对大鼠分泌性中耳炎的抑制作用

2023-12-04李艳峰卢振民

现代药物与临床 2023年10期

李艳峰，卢振民

新乡医学院第一附属医院耳鼻咽喉科，河南新乡 453100

分泌性中耳炎为耳鼻喉科常见的疾病之一，是一种中耳非化脓性疾病，以中耳积液、听力损伤及鼓膜浑浊内陷为特征，常发病于儿童，且其发病率呈逐年增高态势，已经成为危害人类身体健康的突出问题[1]。目前，有关于分泌性中耳炎的发病机制尚未完全阐明，其病因机制仍然存在一定的争议。多项研究证实，炎症效应被认为是导致中耳黏膜损伤及听力受损的主要病因，通过改善机体免疫功能并予以抗炎处理是缓解分泌性中耳炎症状的重要方式[2-3]。细胞焦亡作为一种新型促炎性细胞死亡方式，能够通过诱发慢性炎症反应，加速疾病进展。研究证实，细胞焦亡是一种依赖于Caspase-1 介导的细胞死亡形式，主要是以pro-Caspase-1 活化形成Caspase-1 p20，诱导焦亡执行蛋白消皮素 D（GSDMD）发生剪切形成具有细胞毒性的GSDMDN，并募集至细胞膜上形成焦亡小孔，促进白细胞介素（IL）-1β、IL-18 释放，进而诱发炎症级联反应[4]。多项研究均已证实，在多种炎症相关性疾病中均存在细胞焦亡的发生，而通过药物/基因干预细胞焦亡能够抑制机体过度炎症反应，进而改善疾病症状[5-6]。结合分泌性中耳炎以炎症反应为核心的疾病主要病理机制，提示细胞焦亡很有可能是分泌性中耳炎中耳黏膜损伤的新机制。腺苷酸活化蛋白激酶/NOD 样受体蛋白3（AMPK/NLRP3）是细胞焦亡发生的重要调控通路，抑制或降低AMPK 活性能够明显激活NLRP3 炎症小体，从而启动细胞焦亡[7]。此外，AMPK 和NLRP3 炎症小体已被证实在分泌性中耳炎体外和体内实验中发挥关键性调控作用[8-9]。以上研究共同提示，以AMPK/NLRP3通路介导的细胞焦亡为研究切入点可能是揭示分泌性中耳炎新的病理机制及以此探寻新型治疗药物的关键。

牡荆素是一种天然的生物活性黄酮类化合物，多存在山楂叶及其果实、山里红叶、金莲花等中药材中。研究证实，牡荆素具有抗氧化[10]、抗炎[11]、抗肿瘤[12]等多种生物学功能，且对疾病的防治效果显著，相比于临床药物具有不良反应小、安全性高等优势，是一种极具开发潜力的天然活性物质。研究表明，牡荆素能够通过抑制炎症反应，改善关节炎大鼠症状[11]。此外，牡荆素亦能够通过抑制炎症反应，改善哮喘幼鼠肺部损伤[13]。但是，关于牡荆素对分泌性中耳炎炎症反应的影响及作用机制尚不清楚。为此，本研究拟通过内毒素法构建分泌性中耳炎大鼠模型，从AMPK/NLRP3 通路介导的细胞焦亡途径，阐明牡荆素对分泌性中耳炎大鼠的保护作用，旨在为分泌性中耳炎临床候选治疗药物提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物雄性，SPF 级，周龄6～8 周，SD 大鼠50 只，体质量为（200±10）g，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司[生产许可证号SCXK（沪）2021-0026]，动物适应性饲养1 周，期间正常饮食、饮水。饲养条件：（25±2）℃，环境相对湿度55%～65%，昼夜各12 h 交替光照。本实验中涉及的动物研究经过新乡医学院第一附属医院医学伦理委员会审批（批准号LLSC2021-06-010）。

1.1.2 主要试剂牡荆素（质量分数＞98%，批号20220312，成都植标化纯生物技术有限公司）；内毒素（美国Sigma-Aldrich 公司，批号L6529）；AMPK抑制剂6-[4-(2-哌啶-1-基乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1,5-A]嘧啶（Compound C）（美国Selleck 公司，批号S7306）；免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号SP-9001）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-1β、IL-18 酶联免疫吸附检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号SEKR-0009、SEKR-0005、SEKR-0002、SEKR-0019）；苏木素-伊红（HE）检测试剂盒、BCA 蛋白质浓度测定试剂盒、ECL 发光液、β-actin 一抗、HRP 标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG（碧云天生物技术公司，批号C0105S、P0009、P0018FS、AF0003、A0412、A0408）；p-AMPK 一抗、AMPK一抗、Caspase-1p20 一抗、GSDMD-N 一抗、IL-1β一抗、IL-18 一抗（美国Cell Signaling Technology，批号2537、2532、89332、37349、63124、57058）。

1.1.3 主要仪器 LD-96A 型酶标仪（山东莱恩德智能科技有限公司）；BX53 型光学显微镜（日本Olympus 公司）；BX43 型荧光显微镜（日本Olympus公司）；580-NAVPR2 型ABR 电位仪（上海沫锦医疗器械有限公司）；Gel dox XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分泌性中耳炎大鼠模型的构建以及分组给药将50 只SD 大鼠随机性分为对照组、模型组、牡荆素（3、12 mg/kg）组、牡荆素高剂量＋Compound C 组，每组各10 只。显微镜下观察大鼠外耳道及中耳感染情况排除中耳感染性大鼠。除对照组外，其余各组大鼠均采取内毒素法复制分泌性中耳炎大鼠模型[14]：0.4%的戊巴比妥钠麻醉大鼠，大鼠仰卧位固定，在手术显微镜下经鼓膜穿刺，采用微量注射器注射内毒素（200 ng/mL）。造模后光学显微镜下观察大鼠鼓膜浑浊、内陷以及分泌液等状况，若大鼠鼓膜出现明显浑浊，内陷且伴有气泡形成，鼓室积液，视为模型构建成功。建模后鼓膜充血，光锥消失，无穿孔。本实验中分泌性中耳炎大鼠造模成功率为100%。造模成功后1 d，牡荆素3、12 mg/kg组分别 ip 相应剂量的牡荆素[15]；牡荆素＋Compound C 组ip 12 mg/kg 的牡荆素后，立即ip 20 mg/kg Compound C[16]；对照组和模型组大鼠分别ip等量的生理盐水。以上各组均为1 次/d，连续给药21 d。

1.2.2 中耳黏膜组织病理学观察给药结束后各组大鼠均颈椎脱臼处死，解剖内耳，4%多聚甲醛固定，脱钙，脱水，石蜡包埋切片，行HE 染色，显微镜下观察中耳黏膜组织病理形态变化。

1.2.3 中耳黏膜厚度测定将大鼠颈椎脱臼处死后，解剖头部并分离听泡，滤纸吸除听泡水分，于显微镜下剥离中耳黏膜组织，最后利用测微计测定各组大鼠黏膜组织厚度，每组测量5 个不同位置，取其平均值为最终黏膜厚度。

1.2.4 大鼠听力功能检测各组大鼠给药结束后24 h，采取听觉脑干诱发电位（ABR）仪检测ABR反应阈值，以此反映听力功能变化。各组大鼠麻醉后，置于隔声屏蔽室内，依据文献报道[3]严格按照ABR 仪器操作方法进行ABR 反应阈值测定。

1.2.5 ELISA 检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平给药结束后，大鼠腹主动脉取血，4 ℃，3 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，按照ELISA 检测说明书测定各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平。

1.2.6 免疫组化检测中耳黏膜组织p-AMK、NLRP3蛋白阳性表达将脱蜡、透明、脱水后的黏膜组织切片抗原修复，经3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭非特异性位点后，4 ℃孵育p-AMPK一抗（1∶200）、NLRP3 一抗（1∶500）过夜，室温条件下孵育对应二抗30 min，最后滴加DAB 显色液，经苏木精复染、脱水、封片处理，显微镜下观察黏膜组织p-AMPK、NLRP3 蛋白表达，并经Image J 软件对染色结果进行半定量分析。

1.2.7 Western blotting 检测AMPK/NLRP3 通路及焦亡相关蛋白表达收集各组大鼠中耳黏膜组织，剪碎后混合加入蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，于4 ℃条件下，裂解30 min。将离心管放置于离心机内并设置：4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液。BCA 法测定蛋白质浓度，蛋白质变性，蛋白上样，电泳、转膜。室温条件下PVDF 采用6%BSA 封闭1 h，TBST 洗膜后，4 ℃条件下，分别孵育p-AMPK 一抗（1∶500）、AMPK 一抗（1∶1 000）、NLRP3 一抗（1∶1 000）、Caspase-1 p20 一抗（1∶500）、GSDMD-N 一抗（1∶500）、IL-1β 一抗（1∶1 000）、IL-18 一抗（1∶1 000）、β-actin 一抗（1∶5 000）16 h。次日取出PVDF 膜，TBST 洗涤后加入相应HRP 标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG 孵育2 h。TBST 洗涤3 次，每次5 min。最后于PVDF膜上滴加显影液显影、拍照，实验结果采用Image J 软件进行p-AMPK、AMPK、NLRP3、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白表达定量分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 牡荆素对大鼠中耳黏膜病理形态改变和黏膜厚度的影响

对照组大鼠中耳内黏膜上皮细胞排列整齐，血管及纤维细胞含量丰富，未有明显的炎性细胞浸润等现象。模型组大鼠中耳黏膜细胞肿胀，黏膜组织明显增厚（P＜0.05），有多处黏膜细胞脱落，坏死，可见大量炎性细胞浸润。与模型组相比，牡荆素3、12 mg/kg 组大鼠，黏膜上皮细胞排列较为规整，肿胀程度减轻，仅有少量的黏膜细胞脱落，炎性细胞浸润程度减轻，中耳黏膜厚度降低（P＜0.05），且伴随牡荆素剂量的增加，中耳黏膜病理损伤及黏膜厚度均减轻。与牡荆素12 mg/kg 组相比，牡荆素＋Compound C 组大鼠中耳黏膜组织病理损伤程度加重，且黏膜厚度增加（P＜0.05），见图1、表1。

表1 各组大鼠中耳黏膜厚度比较（，n=10）Table 1 Comparison of thickness of middle ear mucosa in each group (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与牡荆素3 mg·kg-1 组比较：&P＜0.05；与牡荆素12 mg·kg-1 组比较：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

图1 各组大鼠中耳病理学变化（HE，×200）Fig.1 Pathological changes in the middle ear of rats in each group (HE,×200）

2.2 牡荆素对大鼠听觉功能的影响

与对照组相比，模型组大鼠ABR 反应阈值明显增加（P＜0.05）。与模型组相比，牡荆素3、12 mg/kg 组大鼠ABR 反应阈值明显降低（P＜0.05），且呈剂量相关性。与牡荆素12 mg/kg组相比，AMPK抑制剂Compound C 能够增加大鼠ABR 反应阈值（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠ABR 反应阈值比较（，n=10）Table 2 Comparison of ABR response thresholds in each group of rats (,n=10)

2.3 牡荆素对大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平影响

与对照组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平明显增加（P＜0.05）。与模型组相比，牡荆素3、12 mg/kg 组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平均明显降低（P＜0.05），且呈剂量相关性。与牡荆素12 mg/kg 组相比，牡荆素＋Compound C 组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平明显增加（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18 水平比较（，n=10）Table 3 Comparison of serum TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-18 levels in each group of rats (,n=10)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与牡荆素3 mg·kg-1组比较：&P＜0.05；与牡荆素12 mg·kg-1 组比较：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

2.4 牡荆素对大鼠中耳黏膜细胞焦亡相关蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠中耳黏膜组织Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，牡荆素3、12 mg/kg 组大鼠中耳黏膜组织Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.05），且呈剂量相关性。与牡荆素12 mg/kg组相比，AMPK 抑制剂Compound C 能够明显逆转上述蛋白表达（P＜0.05），见图2、表4。

表4 各组大鼠中耳黏膜组织Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白相对表达量（，n=6）Table 4 Relative expression of caspase-1p20,GSDMD-N,IL-1β,and IL-18 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与牡荆素3 mg·kg-1组比较：&P＜0.05；与牡荆素12 mg·kg-1 组比较：@P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs vitexin 3 mg·kg-1 group;&P <0.05 vs vitexin 12 mg·kg-1 group

图2 各组大鼠中耳黏膜组织Caspase-1p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18 蛋白凝胶电泳图Fig.2 Gel electrophoresis of caspase-1p20,GSDMD-N,IL-1β and IL-18 proteins in middle ear mucosa of rats in each group

2.5 牡荆素对大鼠黏膜组织中AMPK/NLRP3 通路相关蛋白表达的影响

免疫组化染色结果显示，与对照组相比，模型组大鼠中耳黏膜组织p-AMPK 阳性表达明显减少，NLRP3 阳性表达明显增加（P＜0.05）。与模型组相比，牡荆素3、12 mg/kg 组大鼠中耳黏膜组织p-AMPK 阳性表达显著增加，NLRP3 阳性表达明显减少，且呈剂量相关（P＜0.05）。与牡荆素12 mg/kg组相比，AMPK 抑制剂Compound C 能够明显逆转p-AMPK、NLRP3 阳性表达（P＜0.05），见图3、表5。Western blotting 检测显示，模型组大鼠中耳黏膜组织p-AMPK 蛋白表达降低，NLRP3 蛋白表达增加（P＜0.05）。与模型组相比，牡荆素3、12 mg/kg组大鼠中耳黏膜组织p-AMPK 蛋白表达升高，NLRP3 蛋白表达降低（P＜0.05），且呈剂量相关性。与牡荆素 12 mg/kg 组相比，AMPK 抑制剂Compound C 能够明显逆转p-AMPK、NLRP3 蛋白表达（P＜0.05），见图4、表6。

表5 各组大鼠中耳黏膜组织p-AMPK、NLRP3 蛋白阳性表达比较结果（，n=6）Table 5 Comparison of p-AMPK and NLRP3 protein positive expression in middle ear mucosa tissues of rats in each group (,n=6)

表6 各组大鼠中耳黏膜组织p-AMPK/AMPK、NLRP3 蛋白相对表达量（，n=6）Table 6 Relative expression of p-AMPK/AMPK and NLRP3 proteins in the middle ear mucosa of rats in each group (,n=6)

图3 免疫组化检测p-AMPK、NLRP3 阳性表达（IHC，×200）Fig.3 Immunohistochemical detection of positive expression of p-AMPK and NLRP3 (IHC,× 200)

图4 各组大鼠中耳黏膜组织p-AMPK、AMPK、NLRP3蛋白凝胶电泳图Fig.4 Gel electrophoresis of p-AMPK,AMPK and NLRP3 protein in middle ear mucosa of rats in each group

3 讨论

中耳炎可分为化脓性和非化脓性中耳炎，是由多种原因诱发的中耳全部或部分中耳炎性病变。非化脓性中耳炎是导致儿童听力损伤以及言语功能障碍的临床常见疾病，具有一定的自限性，但是仍有20%～40%患者会出现反复发作，严重的影响了患者的生活质量[17]。因此，积极探寻分泌性中耳炎的病因及机制并予以药物干预治疗是临床治疗规范方案治疗的前提。

炎症基因和细胞因子诱发的免疫炎症是分泌性中耳炎的主要致病因素，抑制炎症细胞因子释放，可显著恢复中耳通气，改善分泌性中耳炎[18-19]。牡荆素主要是从山楂叶总黄酮分离、纯化而得到的活性单体化合物，具有显著的抗炎作用，能够明显减轻关节炎症状，并通过抑制炎症因子表达改善葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎[20]。基于以上研究，推测牡荆素可能通过抑制炎症反应发挥分泌性中耳炎治疗作用。

本研究通过构建分泌性中耳炎大鼠模型，观察牡荆素对其治疗作用。研究发现，牡荆素能够通过抑制炎症因子释放，改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜病理性损伤。但是，有关牡荆素是通过何种机制抑制炎症反应发挥抗分泌性中耳炎作用尚未完全阐明。细胞焦亡为炎症性细胞死亡方式，广泛参与多种疾病的发生发展。多项研究已证实，抑制Caspase-1 介导的细胞焦亡能够明显降低炎症因子释放，进而改善疾病症状[21-22]。袁玥等[23]研究证实，细胞焦亡的发生及其过程中的相关促炎症细胞因子的释放，会导致炎症反应进一步扩大，加重气道炎症性疾病的进展，提示细胞焦亡可能参与分泌性中耳炎炎症反应过程。Ding 等[24]研究证实，牡荆素能够通过抑制GSDMD 介导的细胞焦亡，降低炎症因子水平，进而缓解草酸钙晶体诱导的肾结石小鼠症状。既往研究共同提示，牡荆素可能通过调控细胞焦亡通路发挥抗分泌性中耳炎作用。基于此，本研究检测了焦亡相关蛋白表达，结果发现牡荆素能够明显抑制焦亡相关蛋白表达，降低炎症反应，进而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜损伤。AMPK/NLRP3 信号通路是与细胞焦亡发生密切相关。研究证实，NLRP3 炎症小体的组装是激活细胞焦亡过程中关键基因Caspase-1 的前体，当细胞受到外界危险信号刺激后，NLRP3、ASC 及pro-Caspase-1 三者会组装为NLRP3 炎症小体蛋白复合物，导致pro-Caspase-1 裂解形成具有活性的cleaved-Caspase-1（Caspase-1p20）诱导细胞焦亡发生[25]，此过程可由AMPK 通路调控[26]。此外，抑制AMPK信号通路可显著促进NLRP3 炎症小体活化，从而启动细胞焦亡[27]。以往研究也证实，AMPK 和NLRP3 炎症小体参与中耳炎疾病的发生发展，激活AMPK 通路或是抑制NLRP3 炎症小体活化介导的炎症反应能够明显改善内皮细胞及中耳黏膜的损伤[28-29]，提示AMPK、NLRP3 基因可能是分泌性中耳炎疾病发生的重要调控因子。此外，Zhang 等[30]研究证实，牡荆素能够通过抑制NLRP3 炎症小体介导的炎症反应改善慢性脑缺血性神经损伤。Inamdar 等[31]研究发现，牡荆素能够通过激活AMPK 信号通路，改善高脂饮食喂养诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病变。以上研究共同表明，牡荆素很有可能通过调控AMPK、NLRP3 蛋白表达，发挥抗分泌性中耳炎作用。本研究结果显示，与模型组相比，牡荆素能够激活AMPK 通路，抑制NLRP3 蛋白表达，从而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜损伤，表明牡荆素可能通过调控AMPK/NLRP3 通路，抑制分泌性中耳炎大鼠细胞焦亡。邓宏哲等[32]研究证实，人参皂苷Rg1 能够通过激活AMPK 途径抑制NLRP3 炎症小体活化介导的细胞焦亡，发挥抗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化保护作用，且此保护作用可被AMPK 抑制剂Compound C 逆转。为进一步明确AMPK/NLRP3 通路在牡荆素抑制分泌性中耳炎中的作用，本研究通过对牡荆素高剂量大鼠ip AMPK 抑制剂，观察牡荆素对大鼠分泌性中耳炎的作用能否被逆转。结果显示，与牡荆素组相比，AMPK 抑制剂Compound C 能够抑制AMPK 通路，促进NLRP3 炎症小体活化介导的细胞焦亡，诱发炎症反应，损害分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜组织，从而逆转牡荆素对分泌性中耳炎的保护作用。以上研究结果进一步证实了牡荆素改善大鼠分泌性中耳炎与调控AMPK/NLRP3 介导的细胞焦亡相关。

综上所述，本研究通过探讨牡荆素对分泌性中耳炎大鼠炎症的影响及机制。结果发现，牡荆素能够通过活化AMPK，抑制NLRP3 炎症小体活化介导的细胞焦亡，减轻炎症反应，从而改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜损伤。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突