犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备

薛姣雄,赵婷芳,张 倩,唐青海,*,高翠翠,赵 铖,张 妍,全飞杨,刘 婷,杨 灿,杨 海,王文秀

(1.衡阳师范学院 生命科学学院,南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室,湖南 衡阳 421008; 2.滨州市沾化区科技创新发展研究中心, 山东 滨州 256600; 3.山东省滨州畜牧兽医研究院, 山东 滨州 256600)

犬冠状病毒病是由犬冠状病毒(canine coronavirus, CCV)感染引起的一种以沉郁、厌食、呕吐、腹泻、咳嗽为临床表现的传染性疾病[1]。最新报告表明,该病感染率为100%,病死率为50%左右,针对该病的治疗暂无特效药,以预防和护理为主[2]。CCV属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronaviurs)冠状病毒Ⅰ群[3]。目前,CCV除了已知的CCV-Ⅰ和CCV-Ⅱ两种基因型外,还出现了新的重组CCV变异株[4]。近期,Vlasova等[5]在住院肺炎患者鼻咽拭子中发现了CCV的RNA,并首次在人类肺炎患者中分离出了犬猫重组冠状病毒,可见该病毒可能会引起人畜共患病,危害较大。CCV主要编码4种结构蛋白,即M、E、S、N和其他几个具有潜在未知功能的非结构蛋白[6]。S蛋白是Ⅰ型跨膜融合蛋白,是冠状病毒表面的重要糖蛋白,它与宿主细胞膜上的病毒受体结合并诱导产生抗体,且与病毒的组织嗜性密切相关[7-9]。乔军等[10]对CCV S蛋白主要抗原区基因片段的表达和免疫原性做了研究,表明其具有一定的免疫原性。故CCV S蛋白是免疫诊断制剂、亚单位疫苗和治疗性抗体开发的理想对象。

针对犬冠状病毒病,市面上主要销售CCV灭活苗和弱毒疫苗,但鉴于灭活苗诱导宿主肠道黏膜产生免疫的效果不佳,弱毒疫苗又受限于母源抗体,二者均不能对CCV的感染起到完全的保护预防作用[11-12]。目前的CCV疫苗对犬感染后排毒和阻断病毒传播的效果也不佳[13]。余春等[14]利用毒蜂胶佐剂,通过静水压高压灭活制备CCV灭活苗,优化了免疫效果。孙秋艳等[15]利用水煮醇沉淀法分离提取浒苔多糖,并利用其增强了CCV灭活疫苗的免疫作用。

卵黄抗体(IgY)是一种免疫球蛋白,属于γ球蛋白,由重链(分子量约67～70 ku)和轻链(分子量约25 ku)组成,具有耐酸碱、在常温下更稳定、特异性强等优点[16]。IgY技术在动物腹泻等疾病诊断、预防和治疗中有广泛应用,且IgY效价高、成本低,适宜于大规模生产应用[17-18]。Fan等[19]利用IgY技术,研制了具有高中和活性和热稳定性的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性的抗体制剂,该抗体对不同变异毒株beta、delta、omicron等具有良好的交叉中和活性和高效阻断病毒感染的保护效力,对增强新冠疫苗效果起到重要作用。特异性小分子Fab片段(fragment of antigen binding)是IgY的抗原结合片段,是抗体结构中与抗原结合的区域[20]。Fab抗体片段分子量小、组织穿透能力较强、结合力高,由于缺少Fc段,其免疫原性较低,可广泛用于诊断治疗和基础研究[21-22]。

鉴于CCV疫苗效果不理想、无特效药可用,CCV的卵黄抗体和小分子抗体Fab的制备应用前景广阔。目前,国内尚无CCV S1蛋白卵黄抗体和特异性小分子抗体Fab制备的文献报道,本研究将为CCV新型治疗制剂的研发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、感受态细胞与实验动物

pET28a(+)载体为Novagen公司产品;pGEX4T-1载体为Pharmacia Biotech产品;BL21(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司;Rosetta(DE3)购于北京全式金生物(TransGen Biotech)科技有限公司。

1.1.2 主要试剂、材料

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购于TaKaRa公司;Bacterial Protein Extraction Kit购于北京康为世纪生物科技有限公司;单克隆抗体Mouse Anti-GST mAb、酶标抗体HRP-Goat-Anti-mouse pAb均购于武汉三鹰生物技术有限公司;酶标抗体HRP-Goat Anti-Chicken IgG(H+L)pAb购自Sigma公司;胃蛋白酶(1∶10 000)为北京索莱宝科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 重组CCVS1基因的优化与合成

通过DNAStar7.0软件和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/网站对CCV(GenBank: JQ404409)的S基因进行密码子优化,使其更适合在原核中表达。由TaKaRa公司合成S1基因全长和构建重组质粒JM109-pMD19T-CCV S1。

1.2.2 CCVS1全长和截短片段基因的PCR扩增

将JM109-pMD19T-CCV S1菌液进行过夜培养,次日收集菌液,用试剂盒提取质粒。将质粒稀释100倍作为模板进行PCR扩增,引物序列见表1。PCR扩增程序:94 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 2 min 30 s,35个循环;68 ℃ 10 min,4 ℃保存。

表1 引物序列

1.2.3 CCVS1全长和截短片段基因、载体的酶切与纯化

PCR扩增的CCVS1基因及其截短片段CCVS1-a和CCVS1-b经琼脂糖凝胶电泳后,用PCR产物清洁试剂盒进行纯化,再用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切;同时将pET28a和pGEX4T-1载体置于CCV S1-a-F和CCV S1-a-R扩增的为CCVS1-a片段(1 470 bp),CCV S1-b-F和CCV S1-b-R扩增的为CCVS1-b片段(1 176 bp),CCV S1-a-F和CCV S1-b-R扩增的为CCVS1基因。带下划线的为内切酶位点,GGATCC为内切酶BamHⅠ位点,CTCGAG为内切酶XhoⅠ位点。

相同的反应体系中双酶切。酶切的CCVS1基因、CCVS1-a基因、CCVS1-b基因和空载体通过PCR清洁试剂盒进行纯化浓缩。

1.2.4 CCVS1全长和截短片段原核表达载体的构建与鉴定

将纯化浓缩的目的基因CCVS1及其截短片段CCVS1-a和CCVS1-b分别与载体pET28a或pGEX4T-1过夜连接。次日,将连接液中的质粒分别转化到感受态细胞BL21(DE3)或Rosetta (DE3),构建出重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-CCV S1、BL21(DE3)-pGEX4T-CCV S1、Rosetta (DE3)-pGEX4T-CCV S1、Rosetta (DE3)-pET28a-CCV S1-a、Rosetta (DE3)-pET28a-CCV S1-b、Rosetta (DE3)-pGEX4T-CCV S1-a和Rosetta (DE3)-pGEX4T-CCV S1-b,把转化后的菌株分别涂布于含抗生素的平板培养基上,在恒温培养箱中培养16～20 h,挑取单菌落,在相同条件下扩大培养、保菌、提取质粒。将所提取的质粒进行双酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定,将酶切结果为阳性的重组质粒送至华大基因测序,并利用DNAStar软件分析拼接的序列。

1.2.5 重组蛋白的诱导表达、SDS-PAGE和Western blot检测

取阳性重组表达菌株和相应空载体对照菌株各10 μL分别接种于2 mL含有卡那霉素或氨苄青霉素(终质量浓度为100 μg·mL-1)的液体LB培养基中,37 ℃、220 r·min-1振荡培养16 h,进行首次活化。次日,将首次活化后的菌液按体积比1∶2接种到新的培养基中进行二次活化,37 ℃、220 r·min-1振荡培养3 h。取1组加入IPTG(终浓度为1 mmol·L-1)诱导,剩余的培养基中不加诱导剂IPTG(作为对照组)。使用细菌蛋白提取试剂盒提取上述菌株的蛋白,依次进行SDS-PAGE、转膜、2%脱脂奶粉-PBS封闭、PBST洗涤;然后依次进行一抗(单克隆抗体Mouse Anti-GST mAb)孵育(1∶3 000稀释)、PBST洗涤;再依次进行二抗(二抗酶标抗体HRP-Goat-Anti-mouse pAb)孵育(1∶5 000稀释)、PBST洗涤;最后用DBA显色液显色。

1.2.6 CCV S1-ab蛋白免疫原的制备与动物免疫

对重组菌株CCV S1-a和CCV S1-b进行活化、IPTG诱导表达与超声破碎法提取蛋白,并将2种蛋白等体积混合,采用注射器推注乳化法对每种疫苗的配伍进行乳化操作。佐剂配伍见表2。

表2 佐剂配伍表

取160日龄左右的蛋鸡,分为3组。第1组免疫用ISA71AVG佐剂为乳化剂制备的免疫原,第2组免疫采用ISA201VG佐剂为乳化剂制备的免疫原,分2次免疫,间隔21 d,1 mL·羽-1,采用胸部肌肉注射。首次免疫当天和首次免疫后第21天、第35天采集血清样品,每日收集鸡蛋。第3组鸡不免疫,作为阴性对照。

1.2.7 IgY的提取和免疫活性鉴定

利用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取IgY,去除卵黄中的非水溶成分(WIF)得到卵黄抗体。将1.2.5节得到的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后,转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,经封闭、漂洗,将稀释提取的IgY样品作为一抗孵育,依次进行漂洗、HRP-Goat Anti-Chicken IgG (H+L)(1∶10 000倍稀释)孵育、漂洗,用DAB显色试剂盒显色。IgY按初始浓度1∶1 000稀释,然后在此基础上进行2倍比稀释直到1∶128 000,反应结果为阳性的最大稀释度即为IgY抗体滴度。

采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测IgY与病毒的反应活性,将猫肾上皮细胞(CRFK细胞)接种到96孔细胞培养板,待细胞在96孔板内长到密度为90%时,将原培养基更换为无血清DMEM培养基。随后,将CCV-HY17毒株接种至CRFK细胞上,感染24 h后弃培养基,用体积分数33%丙酮-PBS固定30 min,真空干燥后加入IgY(1∶1 000稀释),设阴性卵黄抗体作为对照组,37 ℃孵育1 h,用PBS洗涤3次,然后加入HRP-Goat Anti-Chicken IgG (H+L) pAb(1∶3 000稀释),37 ℃孵育1 h,PBS洗涤3次,每孔加入AEC显色液100 μL,37 ℃孵育30 min,弃去显色液加入去离子水终止反应,于倒置显微镜下观察、判定结果。

1.2.8 小分子抗体Fab的制备与条件优化

利用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab片段,根据IgY与胃蛋白酶混合质量比(5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、80∶1)、结合时间(10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h)设计正交试验。随后,检测卵黄抗体溶解在不同pH值乙酸钠溶液中的稳定性,并对酶切pH值进行优化,设计2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.1、4.4、4.7、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0共13个梯度,酶切24 h进行预实验,根据预实验结果挑选适宜的酶切pH值;进一步结合不同酶切时间(pH值2.0～3.8条件下分别酶切5 min、10 min、20 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h;pH值4.1～5.0条件下分别酶切10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h)进行正交试验。在其他条件相同且适宜的条件下进行酶切,达到优化酶切条件的目的。

1.2.9 小分子抗体Fab对病毒的阻断活性检测

利用抗体中和病毒的特性测定小分子抗体Fab的活性,先将CCV与小分子抗体Fab按照体积比1∶1混合均匀,37 ℃孵育1 h,设阴性Fab分子对照。将2种Fab分子与病毒孵育的混合液分别接种CRFK细胞(密度约90%),37 ℃孵育4 h,弃上清液,用PBS洗涤3次,加入无血清DMEM,再将其放入37 ℃、体积分数5% CO2恒温培养箱中培养24 h;弃培养基,用PBS洗涤3次,用体积分数33%丙酮-PBS固定30 min,真空干燥后加入前述鉴定好的IgY(1∶1 000稀释),37 ℃孵育1 h,用PBS洗涤3次,再加入HRP-Goat Anti-Chicken IgG (H+L) pAb(1∶3 000稀释),37 ℃孵育1 h,用PBS洗涤3次,每孔加入AEC显色液100 μL,37 ℃孵育30 min,弃去显色液,加入去离子水终止反应,于倒置显微镜下观察、判定结果。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增CCV S1全长基因和截短片段

结果显示,在约3 000 bp、1 500 bp和1 000 bp处各有一特异性条带,表明第1泳道扩增片段与引物设计预期全长CCVS1的PCR产物(2 586 bp)大小相符合,第2和3泳道扩增片段分别与该基因截短片段CCVS1-a的PCR产物(1 470 bp)和CCVS1-b的PCR产物(1 176 bp)大小相符(图1)。

M,DL5 000 DNA分子量标准;1,CCV S1基因PCR产物;2,CCV S1-a基因PCR产物;3,CCV S1-b基因PCR产物。

2.2 重组表达菌株的构建与鉴定

涂有BL21 (DE3)-pET28a-CCV S1、Rosetta(DE3)-pET28a-CCV S1-b菌株的平板未生长出单菌落,其他菌株的平板均生长出单菌落,可进行后续实验。图2在第2、8、10、12泳道约5 000 bp处有载体条带,在约3 000 bp处有基因条带,同CCVS1基因2 639 bp大小相当,而第14、16空载体对照组在约3 000 bp处无条带,表明重组菌株BL21(DE3)-pGEX4T-CCV S1的第2、8泳道和重组表达菌株Rosetta (DE3)-pGEX4T-CCV S1的第10、12泳道为阳性质粒,而剩余泳道为阴性质粒。

A,重组菌株BL21(DE3)-pGEX4T-CCV S1的鉴定;B,重组菌株Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1的鉴定。M,DL 5 000 DNA分子量标准;1、3、5、7均为重组质粒pGEX4T-CCV S1;2、4、6、8均为重组质粒pGEX4T-CCV S1经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切产物;9、11为重组质粒pGEX4T-CCV S1;10、12为重组质粒pGEX4T-CCV S1经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切产物;13和15为对照组pGEX4T-1空质粒;14和16为对照组pGEX4T-1空质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切产物。

如图3所示,在第4、6泳道约1 500 bp处有明显条带,同CCVS1-a基因(1 470 bp)大小相当,在第9、10、11、12泳道约1 000 bp处有目的条带,与1 176 bp的 CCVS1-b基因大小相当,表明重组菌株Rosetta(DE3)-pET28a-CCV S1-a、Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-a和Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-b具有阳性质粒。

A,重组菌株Rosetta(DE3)-pET28a-CCV S1-a和Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-a的鉴定;B,重组菌株Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-b的鉴定。M,DL5 000 DNA分子量标准;1、3,重组质粒pET28a-CCV S1-a;2、4,重组质粒pET28a-CCV S1-a经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切产物;5、7,重组质粒pGEX4T-CCV S1-a;6、8,重组质粒pGEX4T-CCV S1-a经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切产物;9、10、11、12,重组质粒pGEX4T-CCV S1-b经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切产物;13、14、15,重组质粒pGEX4T-CCV S1-b。

2.3 重组蛋白的诱导表达与鉴定

2.3.1 重组表达菌株诱导表达与目的蛋白SDS-PAGE检测

筛选得到的阳性单克隆菌株BL21(DE3)-pGEX4T-CCV S1、Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1和Rosetta(DE3)-pET28a-CCV S1-a经诱导后均未成功表达蛋白。图4-A中,在约79 ku处有目的蛋白,图4-B显示约68 ku处有目的蛋白,初步判定重组表达菌株Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-a和Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-b成功表达了目的蛋白。

A,重组菌株Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-a的SDS-PAGE检测;B,重组菌株Rosetta(DE)-pGEX4T-CCV S1-b的SDS-PAGE检测。M,蛋白分子量标准;1,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a沉淀;2,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a第1次超声破碎的上清液;3,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a第2次超声破碎的上清液;4,未诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a沉淀;5,未诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a上清液;6,诱导表达的pGEX4T-1沉淀;7,诱导表达的pGEX4T-1上清液;8,未诱导表达的pGEX4T-1沉淀;9,未诱导表达的pGEX4T-1上清液;10,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b沉淀;11,未诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b沉淀;12,诱导表达的pGEX4T-1沉淀;13,未诱导表达的pGEX4T-1沉淀;14,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b第1次超声破碎的上清液;15,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b第2次超声破碎的上清液;16,诱导表达的pGEX4T-1上清液;17,未诱导表达的pGEX4T-1上清液。

2.3.2 重组蛋白的Western blot鉴定

图5-A中,70～95 ku处,泳道1和泳道2有特异性条带,其分别为目的蛋白S1-a的包涵体形式和可溶性形式(与预期分子量79 ku相近),未诱导的重组菌对照(泳道4和泳道5)无对应的条带,空载体pGEX4T-1菌株诱导后在26 ku处有GST标签蛋白的表达(泳道6和泳道7),未诱导的空载体pGEX4T-1菌株在26 ku处也有少量GST标签蛋白的表达(泳道8和泳道9),说明该载体在未加IPTG的情况下载体有一定的背景表达。图5-B中,泳道10(重组表达菌)在约70 ku处(与预期分子量68 ku相近)有一特异性条带,为诱导的S1-b的包涵体形式,且泳道14也有相应的一条特异性条带,为可溶性的形式;未诱导的重组菌包涵体(泳道11)及其上清液(泳道15)在70 ku左右均无特异性条带,空载体pGEX4T-1菌株诱导与未诱导所表达的标签蛋白GST与图5-A中的情况相似。这些结果表明,重组蛋白CCV S1-a和CCV S1-b均成功表达,且以包涵体和可溶性2种形式存在。

A,Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-a 蛋白的Western bolt鉴定;B,Rosetta(DE3)-pGEX4T-CCV S1-b蛋白的Western bolt鉴定。M,蛋白分子量标准;1,诱导表达的 pGEX4T-CCV S1-a沉淀;2,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a第1次超声的上清液;3,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a第2次超声的上清液;4,未诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a沉淀;5,未诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a上清液;6,诱导表达的pGEX4T-1沉淀;7,诱导表达的pGEX4T-1上清液;8,未诱导表达的pGEX4T-1沉淀;9,未诱导表达的pGEX4T-1上清液;10,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b沉淀;11,未诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b沉淀;12,诱导表达的pGEX4T-1沉淀;13,未诱导表达的pGEX4T-1沉淀;14,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b上清液;15,未诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b上清液;16,诱导表达的pGEX4T-1上清液;17,未诱导表达的pGEX4T-1上清液。用虚线框标识重组目的蛋白条带。

2.4 CCV S1-a和CCV S1-b蛋白的大量表达与纯化鉴定

重组蛋白经纯化后分别经SDS-PAGE和Western blot鉴定,结果如图6所示。CCV S1-a蛋白在第1泳道79 ku处有清晰目的条带,CCV S1-b蛋白在第2泳道68 ku处有明显目的条带,且纯度较高。图6-B中泳道1和泳道2还有与GST单抗反应、小于预期分子量的条带,说明蛋白存在降解情况。空载体诱导的GST标签蛋白对照在26 ku处有特异性的一条带,证明阳性对照成立。

A,SDS-PAGE检测;B,Western blot鉴定。M,蛋白分子量标准;1,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-a沉淀;2,诱导表达的pGEX4T-CCV S1-b沉淀;3,诱导表达的pGEX4T-1沉淀。

2.5 CCV S1-ab蛋白IgY的提取和透析及免疫活性鉴定

提取、透析后的IgY SDS-PAGE检测结果表明,所提取的IgY在67～70 ku和25 ku有明显的重链和轻链条带,与文献[23]报道一致,所提取的IgY杂蛋白较少,纯度较高。透析后将小分子量的杂蛋白和残留的PEG去除,使其纯度达到更高水平(图7)。IgY质量浓度测定结果表明,透析前最高质量浓度约3.821 7 mg·mL-1,最低质量浓度约3.587 5 mg·mL-1,即每毫升卵黄可提取0.764～1.131 mg IgY;透析后最高质量浓度约3.334 7 mg·mL-1,最低质量浓度约3.029 9 mg·mL-1。IgY效价检测结果表明,重组CCV S1-ab蛋白可刺激鸡产生相应的IgY,注射ISA201VG和ISA71VG佐剂的鸡抗体滴度一免后第21天达到64 000倍,第35天达到128 000倍(图8)。如图9-A所示,病毒抗原均在细胞质中呈棕红色着色,细胞核无着色,阴性IgY与CCV感染细胞无特异性反应(图9-B),说明所制备的IgY可与CCV呈特异性反应。

M,蛋白分子量标准;1、3、5,透析前卵黄抗体;2、4、6,透析后卵黄抗体。

M,蛋白分子量标准;1～6依次为稀释4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000倍的IgY。

A,所制备的特异性IgY与CCV反应;B,阴性IgY与CCV反应。

2.6 胃蛋白酶酶切IgY制备特异性小分子抗体Fab条件优化

将不同质量浓度的胃蛋白酶液取样进行SDS-PAGE检测,结果表明胃蛋白酶含量较低时,在蛋白电泳胶上无任何条带,对于观察酶切产物SDS-PAGE结果无影响(图10-A)。

A,不同质量浓度胃蛋白酶溶液稀释成100 μL体系;B～F,依次为IgY与胃蛋白酶混合质量比为5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、80∶1酶切SDS-PAGE检测结果。M,蛋白分子量标准;1～5依次为6.4、3.2、1.6、0.8、0.4 mg·mL-1胃蛋白酶溶液稀释成100 μL体系;6,IgY原液;7～14依次为酶切10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h。

IgY与胃蛋白酶混合质量比和不同时间梯度酶切正交试验SDS-PAGE结果表明,IgY与胃蛋白酶混合质量比为5∶1、10∶1和80∶1时,均在约40 ku和26 ku处有条带,混合质量比5∶1时在2 h后26 ku处条带被消化,混合质量比10∶1时在4 h后26 ku处条带被消化,混合质量比为80∶1时在约40 ku和26 ku处的条带清晰,可知这3组实验酶切产物纯度不高(图10-B、10-C、10-F)。IgY与胃蛋白酶混合质量比为20∶1和40∶1时,随时间延长40 ku处的条带逐渐被消化,且26 ku处的条带逐渐清晰。混合质量比为20∶1酶切12 h和24 h,以及混合质量比为40∶1酶切24 h可得到纯度较高的产物(图10-D、10-E)。混合质量比为20∶1酶切12 h和24 h,以及混合质量比为40∶1酶切24 h产物的蛋白质量浓度分别为0.871 8、0.884 1、0.978 6 mg·mL-1,兼顾制备效率,初步认为较佳酶切条件为IgY与胃蛋白酶混合质量比20∶1、酶切12 h,或混合质量比为40∶1、酶切24 h。

图11表明,IgY在不同pH值乙酸钠缓冲液中较为稳定,由此可以排除其对后续不同pH值条件下酶切实验的影响。在不同pH值条件下酶切IgY 24 h结果(图12)表明,pH值较低和较高时酶切效果都不佳,在pH值为3.8～5.0时酶切效果较好。鉴于在pH值2.0～3.5时可能由于酶切速度较快,导致目的条带被消化,故本研究采用pH值为2.0～5.0的8个pH值梯度与不同酶切时间进行正交试验。

M,蛋白分子量标准;1～13依次为pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.1、4.4、4.7、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0乙酸钠缓冲液溶解的卵黄抗体。

M,蛋白分子量标准;1～13依次为pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.1、4.4、4.7、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的酶切产物。

随着pH值的增加酶切速率呈现出越来越慢的趋势,pH值为2.0、2.5时,无任何条带(图13-A、13-B);pH值为3.0、3.5时,分别在第11-13号和第11-17号泳道26 ku处出现较浅条带,可推测此时目的蛋白受到了损失,酶切效果不佳(图13-C、13-D);pH值5.0时,26 ku上方存在明显杂带,产物纯度不够(图13-I);pH值为3.8时,酶切4 h和8 h出现较纯的目的条带,经检测其质量浓度分别为0.241 3、0.195 5 mg·mL-1,质量浓度较低(图13-E);pH值为4.1、酶切8 h、12 h和24 h时可得到较纯的蛋白,质量浓度依次为0.940 3、0.812 0、0.400 5 mg·mL-1(图13-F);pH值为4.4和4.7时,酶切24 h,可得到较纯的蛋白,质量浓度依次为0.995 9、0.644 4 mg·mL-1(图13-G、13-H)。综上所述,pH值的4.1、酶切8 h时效率最高,得到的Fab片段纯度和质量浓度均较高。

A～I,pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.1、4.4、4.7、5.0时不同酶切时间的产物。M,蛋白分子量标准;1～8依次为酶切5 min、10 min、20 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h;9,pH值2.0的IgY原液;10,对应pH值的IgY原液;11～18依次为酶切5 min、10 min、20 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h;19,对应pH值的IgY原液;20～27依次为酶切10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h。

2.7 小分子抗体Fab对病毒的阻断活性检测

阻断试验表明,特异性小分子Fab孵育CCV感染的CRFK细胞阳性细胞数量(图14-A)显著少于阴性小分子Fab孵育CCV感染的CRFK细胞阳性细胞数量(图14-B),说明通过胃蛋白酶将IgY分子的Fc段消化后制备的Fab段具有较好的中和活性。

3 结论与讨论

本研究合成了CCVS1基因全长,并分别克隆到了2个表达载体pET28a和pGEX4T-1中,分别转化2个表达菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳均未检测到目的条带,说明蛋白没有表达。目前的文献表明,尚无利用原核表达系统表达S1蛋白全长的报道,因此推测可能是因为S1在原核表达系统中难以实现全长表达。乔军等[10]扩增了CCV DXMV株S1基因片段(2 415 bp),利用酵母表达系统表达了S1蛋白(106 ku),且是可溶性表达,可见低等的真核细胞——酵母菌株在表达长片段方面比原核系统更有优势。本研究随后将S1全长截短为2个片段,并成功表达了CCV-S1-a (55-1 470 bp)和CCV-S1-b (1 411-2 586 bp)蛋白,重组蛋白的Western blot鉴定图中含有较多的杂带(图5),这可能是由于使用的一抗和二抗的浓度较高,即稀释倍数过低,从而引起非特异性反应增多,但这并不影响在79 ku和68 ku处有目的蛋白的判定。S蛋白中含有丰富的B细胞表位和T细胞表位。乔军[24]构建了表达S1基因的重组真核表达载体pVAXS和重组腺病毒CAV-2-S1,用它们免疫犬,均可诱导特异性体液免疫和细胞免疫。郝雲峰[25]利用生物信息学方法分析了4个B细胞表位和1个T细胞表位,以柔性肽连接克隆至pET28载体,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达,免疫Balb/c小鼠,中和抗体效价高达1∶178。Hao等[26]将CCV S蛋白的4个片段(91-135 aa,S1基因;377-434 aa,S2基因;647-671 aa,S3基因;951-971 aa,S4基因)和2个T细胞表位串联,克隆到pET28a载体,然后在BL21(DE3)菌株中成功表达并纯化了蛋白,建立了间接ELISA诊断方法。由此可见,采用真核或原核表达制备的CCV S1蛋白均可较好地刺激机体产生特异性的免疫应答,且原核表达的蛋白能刺激较高的中和抗体滴度。本研究将CCVS1基因截成2段,且有20 aa的重复区,保障了表位的完整性,所表达的蛋白以包涵体形式存在,表达量较大,为免疫原的制备奠定了基础。

免疫佐剂是动物疫苗的主要组成成分,免疫佐剂有弗氏佐剂、油乳佐剂、铝盐佐剂3种传统佐剂,以及小分子多肽佐剂、纳米佐剂等新型佐剂[27],不同佐剂对疫苗免疫效果的增强作用存在差异[28]。乔军等[10]用酵母系统制备的CCV S蛋白和弗氏佐剂乳化,免疫3次,中和抗体在1∶8～1∶16;郝雲峰[25]用原核系统制备S蛋白的主要表位和弗氏佐剂乳化,同样免疫3次,中和效价高达1∶178。由此可见,佐剂相同,同一种蛋白采用不同的表达系统和表达策略对蛋白免疫原性也有影响。余春等[14]将CCV分别以压力灭活和甲醛灭活,以蜂胶作为佐剂制备疫苗免疫易感犬,结果显示,二者均能诱导中和抗体,但压力灭活方式制备的抗原效果更佳。可见,病原的灭活方式不同将导致免疫原性的差异。朱文姣等[29]利用弗氏佐剂与COE蛋白混合作为免疫抗原免疫蛋鸡,并利用氯仿抽提法提取IgY,得出抗体免疫效价达到1∶1 000。而本研究采用ISA71AVG佐剂和ISA201VG佐剂分别与纯化的S1蛋白截短片段进行乳化制备免疫原,首次免疫后21 d两种佐剂组的滴度都达到1∶6 400,第35天,两种佐剂组卵黄抗体滴度都达到了1∶128 000,说明本研究使用的两种佐剂免疫增强效果相当,均优于朱文姣等[29]利用弗氏佐剂所得到的IgY效价,这可能是因为佐剂不同,也可能是由于抗原蛋白或提取方式之间存在差异。目前IgY已在多种肠道传染性疾病的治疗和预防中显示了较好的效果[16,30-31],但我国对CCV S1蛋白IgY的制备暂为空白。

本研究所提取的IgY分子结构完整,重链和轻链条带明显、且杂蛋白很少、纯度高,最高质量浓度约为3.821 7 mg·mL-1,最低质量浓度约为3.587 5 mg·mL-1,即每毫升卵黄可提取0.764～1.131 mg IgY。刘铭[32]分别利用水稀释-硫酸铵二次沉淀法、辛酸法、氯仿法提取IgY,其含量分别为3.837、3.422、4.512 mg·mL-1,本研究使用的PEG法与其利用水稀释-硫酸铵二次沉淀法、辛酸法提取的IgY含量相近,但不及其利用氯仿法提取的IgY含量,这可能是因为提取方法不同,也可能是因为个体、品种之间存在差异。经过透析后,去除了IgY中的PEG等物质以保障后续动物试验的安全性,透析后最高质量浓度约为3.334 7 mg·mL-1,最低质量浓度约为3.029 9 mg·mL-1。

国内对鸡IgY Fab片段的相关研究较少。目前,暂无制备CCV S1蛋白特异性小分子抗体Fab的相关文献。IgY由于无铰链结构,经胃蛋白酶酶解后,可制备单价的Fab片段和Fc片段,经过长时间的加热酶切Fc片段会进一步水解[33],由此得到较高纯度的Fab片段。但由于胃蛋白酶活性受pH值等的影响较大,故本研究优化了CCV S1蛋白特异性IgY水解制备小分子抗体Fab的条件,结果表明,IgY与胃蛋白酶混合质量比为40∶1、酶切24 h与混合质量比为20∶1、酶切12 h的酶切产物纯度相近,混合质量比40∶1的质量浓度更高,但鉴于混合质量比40∶1、酶切12 h时具有较多杂蛋白,为了能更稳定地得到较纯Fab片段,研究认为混合质量比20∶1是最佳的IgY与胃蛋白酶混合质量比。pH值2.0～3.5、酶切24 h时目的条带几乎被消化完全,这可能是因为pH值为2.0～3.5时酶活性较强,酶切速度极快,在长时间酶切过程中Fab片段被降解或被胃蛋白酶消化。这一现象并非偶然,周欣[34]、张冯奕驰[35]进行鸡IgY Fab片段制备时也发现酶含量的增加或是酶切时间过长均会促使Fab片段被酶切,从而造成目的片段损失。在pH值为4.4、4.7酶切24 h,pH值4.1酶切8 h时均可得到较纯的Fab抗体,但综合考虑制备效率等,认为pH 4.1酶切8 h为最佳条件,取这一消化条件为最佳条件,可为下游工艺操作留出稳定且充足的时间。邹强等[36]设计了4个酶切pH梯度和4个IgY与胃蛋白酶混合质量比梯度,对胃蛋白酶酶切IgY制备Fab条件进行了优化,结果显示,在IgY与胃蛋白酶混合质量比为40∶1、pH值4.2、酶解9 h的条件下,可得到无Fc片段的特异性抗体Fab′片段;周欣[34]仅在pH值为4.0的情况下对IgY与胃蛋白酶混合质量和酶切时间进行了优化,得到最佳IgY与胃蛋白酶混合质量比为40∶1、酶切1 h;张冯奕驰[35]设计了4个pH梯度、5个IgY与胃蛋白酶的混合质量比梯度,8个酶切时间梯度,在37 ℃、150 r·min-1摇床下进行消化反应,最后得出最佳优化条件为IgY与胃蛋白酶混合质量比1∶0.54、pH值4.0、37 ℃酶切8.5 h。各个酶切结果存在差异可能是由于胃蛋白酶的活性单位不同、溶解酶与抗体所用的乙酸钠含量不同、消化时的环境差异,如在摇床和水浴锅等不同环境,也可能导致条件优化的结果不同。本研究设计了pH值2.0～7.0共13个梯度,以及IgY与胃蛋白酶混合质量比为5∶1、10∶1等5个梯度配合8个不同的消化时间进行了正交优化试验,较其他研究文献[34-36]而言优化条件范围更广、更全面。最后,基于低成本、高效率得到最高质量浓度、纯度Fab片段的条件,本研究确定最佳酶切条件为IgY与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37 ℃酶切8 h,在此条件下约每毫升卵黄可得到0.07～0.1 mg的Fab片段。完整的IgY与CCV反应活性良好,阻断试验表明,小分子Fab与病毒共孵育后,可显著降低CCV的感染性,说明该Fab具有较好的中和活性,这为后续开发CCV新型防治产品提供了高质量的原材料。

综上所述,本试验利用原核表达系统成功制备了CCV S1蛋白的2个截短片段,所制备的IgY效价高、纯度高,得到了酶切IgY制备特异性小分子抗体Fab片段的最优条件,为进一步开展CCV的诊断和防治技术研究奠定了基础。