日粮钙磷水平对马岗鹅生长性能及肝脏基因表达的影响

2023-12-03李虹仪周润盛梁笑玲张楚玥吕祺欣杨长华

浙江农业学报 2023年11期

李虹仪,周润盛,梁笑玲,张楚玥,吕祺欣,杨长华,张茂

(韶关学院英东生物与农业学院,广东韶关 512000)

马岗鹅为广东省江门市马岗镇的名鹅,具有生长速度快、均匀度好、体型适中、产蛋多等特征。随着我国经济及国民消费能力的快速发展,鹅的消费需求随之增长,马岗鹅的养殖也日益规模化。然而我国在鹅的生理生化、营养、饲养及饲料配制技术的系统研究中较为缺乏,没有颁布鹅的相关饲养标准,因此我国鹅的饲养主要参考美国核管理委员会(NRC)禽类营养需要量(1994年版)、法国标准,或沿用其他禽类的标准。

钙和磷是动物体内含量最多的两个矿物质元素,具有重要的营养作用和生理功能,对维持机体的生长发育、生命活动等必不可少。研究表明,日粮中钙磷水平可影响家禽的生产性能、胫骨发育、肉质和血浆生化指标[1];也影响家禽采食量、饲料转化率、骨重和骨灰分含量[2];同时还影响家禽小肠生长性能和钙转运蛋白基因表达水平[3]。

钙磷在鹅的生理活动中同样举足轻重,影响鹅的采食量及平均日增重[4],同时在鹅的神经肌肉运动、免疫功能及肝肾代谢等方面均起着重要的作用[5-6]。白鹅雏鹅期如果日粮中钙含量过高,其生长性能会显著下降,且显著降低肠道的隐窝浓度、绒毛高度[7],同时还会造成雏鹅肾脏损伤,诱发痛风,而肠道的有害菌群丰度也会增高[8]。因此,日粮中适当的钙磷含量才可发挥动物最佳的生产潜力,但不同品种家禽所需要钙磷差异较大,Reyer等[9]研究发现,同为产蛋鸡,两个品种的钙磷需要表现出明显的不同。根据NRC(1994)鹅营养需要,28日龄以上鹅钙需要量为0.6%,有效磷需要量为0.3%,而在生产上马岗鹅饲喂基础日粮后发现槽鹅出现采食量下降的现象,出现以上现象的原因目前未见相关报道。因此,本实验拟以50日龄马岗鹅为研究对象,在饲喂基础日粮的条件下,研究添加不同中钙磷水平对马岗鹅采食量及生长性能的影响,同时检测肝脏转录组水平变化,研究钙磷水平对代谢基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用48只体重相近、体况健康、公母各半的50日龄马岗鹅,随机分为3个组,每组2个重复,每个重复8只,公母各半,每笼饲养2只。预饲养5 d后正式进行饲养实验,试验期为28 d。

1.2 日粮

在相同日粮的基础上(表1) 分别添加0%、0.15%和0.3%的磷酸氢钙,其他营养指标基本保持一致。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.3 材料

RNA Easy Fast 动物组织/细胞总 RNA 提取试剂盒购自天根公司;反转录试剂PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser及荧光定量PCR试剂TB Green®Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) 购自TaKaRa公司;鹅(Goose)糖原磷酸化酶同工酶Ⅱ(GP-Ⅱ)ELISA检测试剂盒购自上海科艾博生物。

1.4 测定项目

1.4.1 采食量、日增重、体重

记录每只马岗鹅每日采食情况、初始体重、14 d体重与28 d体重,计算各试验组马岗鹅的采食量与日增重。日增重=(结测体重-始测体重)/测定天数。

1.4.2 屠宰性能

操作权限设置：为避免因焊机的工作参数被无关人员随意修改，生产出废件，甚至造成生产事故，触摸屏对参数设置和参数组调用部分设置权限，只有取得密码的人员才能进入。

试验结束后从3组马岗鹅中每个笼里各取1只(公母各半)进行屠宰实验。按照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》(NNY/T 823—2004)记录马岗鹅的宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重并计算其屠宰率、全净膛率和半净膛率。

1.4.3 血钙、血磷

在试验28 d对每组马岗鹅进行血液样品采样,静置4 h 后3 000 r·min-1离心,收集血清样品。血钙的测定采用甲基麝香草酚蓝比色法:在碱性溶液中将血清与甲基百里香(MTB)结合,生成蓝色络合物,与相同处理的钙标准液进行比色比较,计算出钙离子含量。血磷的测定采用磷钼酸法:先制备样品分解液,移取试样分解液10 mL于50 mL容量瓶中,加钒钼酸铵显色剂10 mL,用水稀释至刻度,摇匀,常温下放置10 min以下,以0 mL溶液为参比,用1 cm比色皿,在400 nm波长下测定试样分解液的吸光度,用标准曲线查得试样分解液的含磷量。

1.4.4 粪钙、粪磷

在试验结束前2 d,在鹅笼放置粪盘,在固定的时间,分别收集各笼马岗鹅的粪便,为期2 d。将收集好的粪便用10% HCl固氮后用65℃鼓风干燥机干燥,取出置室温下回温制成风干样,称取总质量,记录数据。再将马岗鹅粪便粉碎后放置在培养皿中。具体测定方法同1.4.3节。粪便中钙含量(mmol·L-1)=(测定D值-空白D值)/(标准D值-空白D值)×标准品浓度(2.5 mmol·L-1)。

1.5 转录组测序及分析

采集的肝脏组织样每组随机取3个重复,对照组命名为L1-3,0.15%磷酸氢钙组命名为M1-3,0.3%磷酸氢钙组命名为H1-3,由深圳华大基因(www.genomics.org.cn, BGI)进行转录组的测序。测序结果采用SOAPnuke软件进行序列过滤,过滤后的序列用HISAT软件进行基因组比对[10],使用Bowtie2进行参考基因序列比对,之后再使用RSEM 计算基因和转录本的表达水平[11];使用DEseq2方法进行差异表达基因(DEG) 检测[12];根据DEGs检测结果用R软件中的pheatmap函数进行层次聚类分析;利用在线网站http://www.geneontology.org/和http://www.genome.jp/kegg/分别进行GO功能注释分类以及KEGG通路注释分类,同时使用R软件中的phyper函数进行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

1.6 荧光定量PCR

1.7 鹅糖原磷酸化酶活性检测

将采集的肝脏组织匀浆后3 000 r·min-1离心10min,取上清根据试剂盒说明书进行磷酸化酶活性检测。从室温平衡20 min后的钼箔袋中取出所需板条,设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加上50 μL不同浓度的标准品,样本孔加入50 μL已稀释待测样本。每孔加入100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体,封板后于37 ℃恒温箱温育60 min。弃去液体后用洗涤液洗板5次,每孔各加入50 μL底物A、B,37 ℃避光孵育15 min后,每孔加入50 μL终止液,于450 nm波长处测定各孔的D值。酶活性=[样品浓度(ng·mL-1)×5×400 μL生理盐水]/肝组织质量(g)。

1.8 统计分析

原始数据记录在Excel软件,数据采用IBM SPSS Statistics 25 ANOVA 程序进行方差分析,采用LSD和Duncan’s法进行多重比较,结果用“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 日粮中钙磷水平对马岗鹅生长性能的影响

从图1可以看出,对照组的马岗鹅采食量在前14 d时显著高于0.15%磷酸氢钙组(P<0.05),与0.3%磷酸氢钙组虽然没有显著性差异,但有增高趋势。在14 d后,对照组鹅的采食量均显著高于其他两组(P<0.05)。根据表2显示,对照组马岗鹅整个试验周期的平均日增重显著高于0.15%磷酸氢钙组(P<0.05),而同样与0.3%磷酸氢钙组之间没有显著性差异,但有增高趋势。另外耗料增重比3个组之间没有显著性差异(P>0.05)。

同一处理时间不同处理间没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。

表2 日粮不同钙磷水平下马岗鹅的平均日增重及耗料增重比

2.2 日粮中钙磷水平对马岗鹅屠宰性能的影响

由表3可见,饲喂无额外添加钙磷日粮的马岗鹅其宰前活重、半净膛重和全净膛重均显著高于0.15%磷酸氢钙组(P<0.05),但随着添加量增加到0.3%,两组之间的各种性能均无显著性差异(P>0.05)。

表3 日粮不同钙磷水平下马岗鹅的屠宰性能

2.3 日粮中钙磷水平对马岗鹅血液及粪便中钙磷含量的影响

为了检测日粮中钙磷添加水平是否对马岗鹅血液及粪便中的相关指标产生影响,试验结束前2 d收集粪便并于28 d时采集每只鹅血液,对粪便中及血液中的钙磷含量进行测定,结果显示,不同处理组之间鹅的血钙、血磷及粪磷的含量均无显著性差异(P>0.05,表4),而粪钙的含量则随着日粮钙添加量的增多而增多,且0.3%磷酸氢钙组的含量显著高于其他两组(P<0.05,表4)。

表4 日粮不同钙磷水平下马岗鹅血液及粪便中钙磷的含量

2.4 日粮中钙磷水平对马岗鹅肝脏基因表达的影响

经过比对分析,3个组别的基因表达量发生了变化,从图2可以看出,对照组与0.15%磷酸氢钙组之间变化不明显,而对照组与0.3%磷酸氢钙组之间差异最大,共有166个基因表达上调,262个表达下调。将对照组与0.3%磷酸氢钙组差异最显著的50个基因进行聚类分析,发现这些基因总共聚成3大类,其中两大类基因0.3%磷酸氢钙组的表达显著低于对照组,另一大类则相反(图3)。分别将高表达和低表达基因进行通路富集分析,发现显著高表达基因主要富集在脂肪酸分解代谢及氨基酸代谢中,而显著低表达基因主要富集在糖代谢通路中,其次为脂肪酸合成代谢(图4-A、B)。挑选0.3%磷酸氢钙组与对照组基因表达上调最显著的8个基因和下调最显著的8个基因在所收集的组织中进行荧光定量PCR检测,结果显示,所有基因的表达趋势与转录组结果一致(图5-A、B)。

L表示对照组,M表示0.15%磷酸氢钙组,H表示0.3%磷酸氢钙组,下同。

图3 差异基因聚类图

A,0.3%磷酸氢钙组表达显著高于对照组基因所富集通路;B,0.3%磷酸氢钙组表达显著低于对照组基因所富集通路。

A,0.3%磷酸氢钙组表达显著高于对照组前8个基因的荧光定量PCR检测结果;B,0.3%磷酸氢钙组表达显著低于对照组前8个基因的荧光定量PCR检测结果。*、**分别表示与对照相比差异达显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)水平。

2.5 日粮中钙磷水平对马岗鹅肝脏中磷酸化酶(GP)活性的影响

在差异基因表达中数量最多的是糖代谢相关酶,基于现有试剂盒的筛选,检测所有组别鹅肝脏组织的GP活性。结果显示,对照组的马岗鹅肝组织中GP活性显著高于其他两组(P<0.05),且随着日粮中钙磷水平提高,肝脏中的GP活性逐渐减少(表5)。

表5 日粮不同钙磷水平下马岗鹅肝脏中GP活性

3 讨论

3.1 日粮中不同钙磷水平对马岗鹅生长性能的影响

食物的摄入是动物生长状况的首要保障,采食量的高低在很大程度上影响了动物的生长性能。在本研究中,饲喂基础日粮组的马岗鹅采食量明显高于其他两组,原因可能是在低钙磷的情况下,马岗鹅为了摄取足够的营养,从而刺激其在短期内增加采食来填补所需营养,导致采食量增加的现象。由于对照组鹅的采食量最大,日增重也相应最大。Alagawany等[6]报道,日粮中钙水平对其所研究的埃及鹅的生长性能性状均无显著影响。孙巍等[13]在其研究的钙水平范围内发现不同钙水平对农安鹅肉的品质亦无显著影响,但有随钙含量提高而品质下降的趋势。而在1日龄的霍尔多巴吉鹅日粮中添加不同剂量的酵母钙发现低添加量能较显著地提高试验鹅的日采食量及平均日增重[4],以上报道与本试验结果不太一致,这可能与不同品种及日龄的影响有关。

3.2 日粮中不同钙磷水平对马岗鹅屠宰性能的影响

屠宰性能可以直观地反映出动物体组成及可食部分的比例,同时也能反映营养物质在组织中沉积量的差异[14]。李园园等[4]在1日龄霍尔多巴吉鹅日粮中添加一系列浓度的酵母钙,发现其屠宰率、半净膛率和全净膛率均与对照组无显著性差异。Alagawany等[6]也报道,在12日龄的埃及鹅日粮中添加各种钙磷比例其各组间屠宰性能亦均无显著差异。本试验中,0.3%磷酸氢钙组宰前活重、半净膛重等屠宰性能均与对照组无显著性差异,与其他研究结果一致,但0.15%磷酸氢钙组的屠宰性能则显著低于对照组,其屠宰性能随着钙磷水平的提高呈现先降后恢复的趋势。而其他相关研究可能其钙磷添加水平均较高,因此均呈现无显著性差异。

3.3 日粮中不同钙磷水平对马岗鹅血液及粪便中钙磷含量的影响

本试验中3个处理组马岗鹅血液中的钙磷含量均无显著性差异,与王宗伟等[15]的研究一致。而不仅是鹅,在鸡上的研究也具有相同的结果[2,16],这可能是因为血液中钙磷的浓度主要是受动物机体内甲状旁腺素、降钙素及维生素D所调节,因此鹅血清中钙的浓度对日粮中摄入钙磷浓度的变化不敏感,血清钙磷水平并不能反映机体钙磷的需求状况,动物体能够通过各种调节机制维持血钙血磷处于正常水平[17]。另外,在本试验中,随着日粮中钙磷水平的提高,粪中钙的含量随之增加,0.3%磷酸氢钙组鹅粪便中钙含量显著高于其他两组,由于肠道排出的钙主要是饲料和消化液中未被吸收的钙,其排出量随食入的钙量和钙的吸收状况而变动[18]。因此,推测0.3%磷酸氢钙组日粮中钙水平可能超过马岗鹅实际所需的营养水平。

3.4 日粮中不同钙磷水平对马岗鹅肝脏基因表达的影响

在检测结果中,对照组与0.15%添加组之间变化不明显,说明这个浓度变化还不足以引起肝脏代谢的较大改变,而对照组与0.3%添加组之间差异则明显加大,说明这个浓度将对肝脏的代谢途径产生影响。KEGG分析得出,0.3%添加组表达显著高于对照组的差异基因主要富集在酮体的合成与分解(synthesis and degradation of ketone bodies)、丁酸代谢(butanoate metabolism)、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的降解(valine, leucine and isoleucine degradation)等通路中,说明日粮中钙磷水平提高将促进马岗鹅机体的脂肪代谢与氨基酸代谢。在定量检测基因中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A)、3-羟基3-甲基戊二酰CoA裂合酶(HMGCL)等主要与脂肪分解相关,说明其主要是促进脂肪的分解;而0.3%添加组表达显著低于对照组的差异基因主要富集在碳代谢(carbon metabolism) 、戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway) 、糖酵解/糖异生(glycolysis/gluconeogenesis) 、丙酮酸代谢(pyruvate metabolism) 和脂肪酸代谢(fatty acid metabolism)这几条通路,说明降低日粮钙磷水平将引起马岗鹅机体糖脂代谢的改变。同时在定量检测基因中,磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、磷酸果糖激酶(PFKL)等基因参与了糖酵解,另外脂肪酸合成酶(FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)等则参与了脂肪的合成,说明降低日粮中钙磷水平在增加采食量的同时,促进体内糖的代谢利用,并使机体脂肪合成增加,这将有利于马岗鹅的育肥及肉质改善。

3.5 日粮中不同钙磷水平对马岗鹅GP活性的影响

GP是糖原分解代谢过程中的关键限速酶,起着催化糖原磷酸化的作用,可促进糖原末端的 α-1, 4-糖苷键断裂并释放出葡萄糖单体[19-20]。糖原磷酸化酶的3种同工酶在体内不同组织中分别发挥不同的生理作用,其中肝型GP主要向肝外组织提供游离的葡萄糖,维持机体正常的血糖浓度[21]。本试验检测马岗鹅肝脏中GP活性结果显示,低钙添加的对照组GP活性显著高于其他两组,与转录组结果相呼应,进一步验证日粮中钙磷水平影响鹅肝脏糖的代谢。