矿质元素与稳定同位素结合的葡萄酒产地鉴别研究

马海燕，王立杉，温昊松，苏颖玥*，张昂*

（1.宁夏职业技术学院，宁夏银川 750021；2.秦皇岛海关技术中心/河北省葡萄酒质量安全检测重点实验室，河北秦皇岛 066000）

葡萄酒具有一定区域特性，通常受葡萄品种、气候条件、酿造工艺等因素共同影响[1]。近年来，葡萄酒市场持续发展，消费者对其质量与安全提出了更高要求，并且开始关注产品地域特征[2]。2021年我国葡萄栽培面积列世界第3位，葡萄酒产量及消费量分别列世界第11位和第7位[3]，已形成黄土高原、云川藏、京津冀、黄河故道、东北及位于西北地区的新疆、河西走廊、贺兰山东麓等10余个葡萄酒产区[4]。通化（GB/T 20820—2007）、烟台（GB/T 18966—2008）、昌黎（GB/T 19049—2008）、沙城（GB/T 19265—2008）和贺兰山东麓（GB/T 19504—2008）等地葡萄酒已被评为国家地理标志产品。但现有国标中均未明确提出产地属性的检测方法，在市场实际监管中存在困难。因此，明确客观参数与不同产地葡萄酒之间的关系，建立快速、准确的检测技术有利于保障其质量，推动产业发展。

矿质元素主要来源于植物生长所在土壤，具有产地属性，在葡萄酒产地鉴别中显示出可行性[5]。在农食产品及医药领域中也受到广泛关注，如大米[6]、茶叶[7]、牛肉[8]、中药材[9]等。近年来，该技术也应用于我国葡萄酒产地鉴别中，李彩虹等[10]在我国6个产区葡萄酒中筛选出35种具有显著性差异的元素，并建立了判别准确率较高的模型。还有学者筛选出6个具有较大产地差异贡献的元素Li、Rb、Sr、Mg、Ti及Cd，并基于元素指纹建立我国葡萄酒判别模型，准确率可达80%以上[11]。然而，矿质元素种类及含量还会受到栽培管理、酿造工艺、环境污染等影响，且在土壤条件相似的地区混淆概率较大[12]。稳定同位素技术在一定程度上弥补了这一问题。欧盟早在上世纪就已经建立了葡萄酒稳定同位素数据库，并将其作为官方检测的有力手段[13]。我国国标中也制定了相应的葡萄酒中稳定同位素的检测方法，如水中氧同位素（QB/T 4853—2015）、甘油碳同位素（QB/T 5299—2018）以及起泡酒CO2的碳同位素（QB/T 4852—2015）等。Fan等[14]测定矿质元素与氧同位素数据，并结合偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和支持向量机（SVM）划分产地，经内部和外部验证的判别准确率可达95%以上。Wu等[15]在判别葡萄酒主要生产国家时，使用3个同位素或13个元素分别划分产区，判别准确率均不高，分别为53.4%和76.4%，但将两者结合分析时，准确率提高到83.9%。故多种技术与数据融合是葡萄酒产地鉴别的有效解决方案，可大大提高模型的准确性及稳定性。

西北产区具有优良的环境气候和地质条件，生产出众多优质葡萄酒。本研究以新疆、河西走廊及贺兰山东麓产区葡萄酒为研究对象，旨在明确西北地区葡萄酒的元素及同位素特征，并结合化学计量学方法评估地理来源，为后续研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品收集

本研究收集了2021年和2022年两个年份的62款干红葡萄酒，其中新疆20款，河西走廊20款及贺兰山东麓22款。新疆产区（XJ）样品来自于阜康、石河子、玛纳斯、昌吉、和硕、焉耆、鄯善及哈密；河西走廊产区（HX）样品来自于黄羊、凉州、张掖、高台及嘉峪关；贺兰山东麓产区（HLS）样品来自于红寺堡、甘城子、芦花台、良田镇、镇北堡、西夏区、玉泉营及石嘴山。葡萄酒品种包括‘赤霞珠’‘美乐’‘蛇龙珠’‘马瑟兰’及混酿。所有样品均取自酒厂储酒罐中，相关质量参数均符合国家标准。

1.2 矿质元素测定方法

1.2.1 样品处理

由于葡萄酒基质复杂，为保证数据的准确性，需在矿质元素测定前去除酒中有机物。本文样品前处理参考Geana等[16]的方法，并做少量修改，具体处理程序如下。取5 mL样品于微波消解管中，置于100 ℃消解系统中（Anton Paar Multiwave 3000，奥地利），使酒精蒸发至约2 mL溶液时取出。将溶液冷却至室温后加入5 mL 65%的HNO3，放入微波消解炉中。设定升温程序为20 min升到190 ℃，并保持5 min。最后消解液在100 ℃浓缩至2 mL，去除剩余HNO3。用2% HNO3溶液于25 mL容量瓶中定容，待测。空白样品与质量控制样品均以相同步骤随试验样品一同进行，每个样品3次重复消解。

1.2.2 仪器参数

采用配有40.68 MHz自激射频发生器的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS, Perkin Elmer，美国）分析元素浓度，并采用自动进样器进样。配制Al、As、Ba、Be、Co、Cr、Cs、Cu、Ga、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、Pb、Rb、Se、Sn、Sr、Ti、V、W、Zn、Zr共24种混合标准溶液（加拿大SCP SCIENCE），浓度范围为2、20、200、1000、5000 μg·L-1，以2%HNO3配置。采用外部标准进行元素浓度定量，每个样品中添加10 μg·L-1的Y元素作为内标。每天测定Ba、Cd、Ce、Cu、In、Mg、Pb、Rh和U的混合标准溶液，浓度为10 μg·L-1，用于检查仪器的日常稳定性。具体仪器参数如下，射频功率：1100 W；等离子气流量15 L·min-1；载气流量：0.94 L·min-1；辅助器气流量：1.2 L·min-1；透镜电压：5.5 V；雾化室温度：2 ℃；蠕动泵转速：0.1 r·s-1；采样流量：0.8 mL·min-1；采样深度：8.0 mm。

1.3 碳稳定同位素测定方法

参考之前研究方法对酒样进行前处理和仪器参数设定[17-19]，使用试剂均为分析纯，试验用水均为超纯水（Milli-Q water，＜18.2 Ω）。酒样稀释100倍，过0.22 μm滤膜后置于进样瓶中。样品中两种物质的分离由流动相和色谱柱完成，配置5 mmol·L-1硫酸为流动相，0.2 mol·L-1磷酸和0.2 mol·L-1过二硫酸钠溶液为氧化剂，以上溶液于超声清洗机中超声5 min，以除去气泡。选择CO2标准气体（δ13C=-10.00‰±0.02）为工作参考气体，购买于中国标准物质中心。将浓度为87.32%的Vodka乙醇标准品（δ13C=27.53‰±0.02）稀释8倍作为质量控制样品，以校准偏移结果。使用液相色谱-同位素比质谱仪（LC-IRMS，DELTA V Plus，ThermoFisher，美国）测定样品，配备Surveyor液相色谱、Isolink接口及自动进样器。由于甘油和乙醇在葡萄酒中含量不同，以不同进样量保证比值的准确性，进样量分别为20 μL和5 μL。流动相流速为0.3 mL·min-1，氧化剂流速为0.1 mL·min-1，色谱柱选择200 mm×7.8 mm的Rezex ROA-Organic Acid H+（Phenomenex，美国），柱温为75 ℃，氧化柱温为99.9 ℃，δ13C分析精度保持在0.1‰。

1.4 氧稳定同位素测定方法

参考国家标准QB/T 4853—2015葡萄酒中水的稳定氧同位素比值（18O/16O）测定方法即同位素平衡交换法。本研究使用仪器为水平衡仪-同位素比质谱（EQIRMS），环境温度保持在23.5 ℃。取200 μL样品过0.22 μm滤膜，置于进样瓶中，充入CO2标准参考气体，于50 ℃保温箱中静置12 h，完成气体交换后，待测。实验室标准以超纯水煮沸并冷却至室温制备，用标准平均海洋水（V-SMOW，δ18O= 0.00‰）校准。具体仪器参数如下：高压（HT电压）为1986 V；半板电压为-10 V；聚集电压为91%HT电压；阱电流为150 μA；电子电压为-80 V；排斥电压为-3 V；总电流为260 mA；磁铁电流为13500 mA。δ18O分析精度在0.2‰。

1.5 数据分析

采用SPSS 24.0软件进行one-way ANOVA及事后多重比较（Dancan's）分析西北产地葡萄酒中矿质元素及同位素分布特征，并对相应数据进行皮尔逊（Pearson's）相关性分析，LDA也由该软件实现，用Origin 2018软件进行PCA及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒中矿质元素产区间差异及相关性分析

2.1.1 矿质元素产区间差异分析

三个产区葡萄酒中元素含量总体趋势较为接近，见表1。Mg元素含量最高，可达到105μg·L-1，其次是Mn、Rb和Sr，含量可达到103μg·L-1，Al、Cu、Ti、Zn、Cr含量在102μg·L-1，Li和Ba元素含量在几十到几百微克每升，其余元素含量均低于10 μg·L-1。24个矿质元素经one-way ANOVA和Duancan's多重比较结果显示，Cs、Cu、Li、Mg、Mo、Ni、Pb、Sn、Ti 9种元素具有显著性差异。Rb/Sr比值在西北3个产区显示出不同，XJ为0.44，HX为0.47，HLS为0.51，可尝试将该比值作为产地鉴别相关参数。OIV规定了As、Cu、Pb、Zn元素在酒中的最大限量分别不超过200、1000、150、5000 μg·L-1，本试验所有样品测定结果均远低于该限定[20]。XJ样品来源范围广，与HX和HLS的元素差异更大，而后两者的元素含量更为接近。

表1 不同产区间元素含量差异分析Table 1 Analysis of element contents difference among different producing areas μg·L-1

2.1.2 葡萄酒中矿质元素相关性分析

葡萄酒中元素含量与各地自然环境和酿造过程密切相关，其相关性是产地元素指纹组成的一部分，具有产地属性。因此，本研究通过Pearson's相关性分析，进一步研究葡萄酒中各元素间关系。在3个产区葡萄酒样品中发现，Ga和Ba的正相关性最强，相关系数达到0.98～0.99。3个产区Cu、Pb、Sn及Cs都与其他元素间呈现更多负相关关系。在新疆产区（图1 XJ），Al和Be也具有较强正相关（R=0.92）；Cu和Ni具有最强负相关，相关性为-0.61。相比XJ和HX产区，贺兰山产区样品（图1 HLS）中显示出更多元素间具有正相关关系，如Zr和Be（R=0.91）、Mn和Co（R= 0.82）、Mg和Li（R=0.80）、W和Al（R=0.78）、W和V（R=0.78）及As和Co（R=0.77）等。从图1 HX中可以看出，河西走廊产区有别于其他两个产区，元素间具有较多较强负相关关系，如Cs和Ti（R=-0.77）、Rb和Ti（R=-0.72）、Rb和Zn（R=-0.64）；还发现Se和As之间（R=0.89）、Sn和Mo（R=0.85）、Zr和Be（R=0.85）之间具有较强正相关关系。

图1 不同产区矿质元素间相关性分析Figure 1 Correlation analysis of mineral elements in different producing areas

将数据经Z-score标准化处理后，进行主成分分析（PCA），结果显示了元素和产地之间的关系（图2），12个主成分方差贡献率为86.76%，主成分1集中了V、Be、Ni、As、Al、Co、Zr、W、Sr、Cr、Mn等信息，主成分2集中了Ba、Ga、Rb、Pb、Cr、Cs等信息。Cu元素与3种同位素均处于主成分1的负半轴，与其他元素在主成分中的贡献不同，可能与栽培中使用含Cu杀菌剂有关。在无监督算法中，3个产区葡萄酒未显示出明显产区划分。

图2 主成分分析得分及元素荷载图Figure 2 Principal component analysis score chart and element load chart

2.2 单体稳定同位素产区间差异分析

甘油碳（δ13Cgly）和乙醇碳（δ13Ceth）稳定同位素比值在3个产区间没有显著性差异，而葡萄酒水中氧同位素（δ18O）具有显著性差异，数据分布范围由图3箱线图显示。图4分别显示了3个地区δ13Cgly、δ13Ceth及δ18O的分布情况。δ13Cgly范围在-33.87‰～-28.15‰，平均值为-31.78‰；δ13Ceth范围在-28.69‰～-23.83‰，平均值为-26.53‰；δ18O范围在-1.32‰～8.91‰，平均值为3.06‰。在Pearson's相关性分析中发现，δ13Cgly和δ13Ceth具有显著相关性（P＜0.05，R2=0.898），拟合线性方程为δ13Ceth=1.125δ13Cgly+9.227。XJ和HX葡萄酒水中δ18O范围分别为2.16‰～8.91‰和1.50‰～8.09‰，整体比δ13C变化范围大。然而，仅使用单体稳定同位素判别葡萄酒产地时存在数据重叠范围，从而导致产地指向性不明确。总之，与葡萄酒中δ13C相比，δ18O受地理环境和气候影响更大，其比值范围更具有地理属性[21]，其他因素的影响程度及规律仍需进一步研究证明。

图3 西北地葡萄酒单体同位素比值分布范围箱线图Figure 3 Distribution range of monomer isotope ratio in wine from Northwest China

图4 三个产区单体同位素比值分布范围Figure 4 Distribution range of monomer isotope ratio in three producing regions

2.3 基于多元统计评估地理来源

判别分析（LDA）在葡萄酒产地鉴别中发挥着重要作用，在许多研究中均得到较高分类准确率[10,15]。在西北产区葡萄酒中应用LDA，以进一步评估地理来源，选择Wilks'Lambda步进法，设定F统计量因子以2.84进入，以1.71除去。样品数据的70%为训练集，30%为预测集，以留一法进行交叉验证。仅以3个同位素数据进行LDA，分类结果显示3个产地整体训练集和预测集均判别效果不佳（55.6%），只在HLS产区判别中效果较好（81.8%），说明同位素是HLS产区判别的关键因素（表2）。

表2 基于同位素的LDA判别结果Table 2 LDA discrimination results based on isotopes

输入变量使用24种矿质元素时，得到样品分类正确率为87.4%，交叉验证准确率为80.9%，3个产区具体分类结果见表3，Li、Ti、Ni、Mo、Pb、Mg及Cs共同构成判别模型；继续增加3种同位素变量，以相同方法处理数据，分类准确率和交叉验证准确率均有明显提高，分别为95.2%和88.9%，3个产区分类结果见表4，Li、Ti、Ni、Cu、Mo、Sn、Pb、Mg、Cs及水中δ18O构成判别模型。可以看出多元素和同位素结合分析有利于提高葡萄酒地理来源识别正确率[12]。图5A、5B分别显示了单独使用矿质元素和使用矿质元素与同位素的LDA得分图，相比于单独使用矿质元素的分析结果，同位素参数的加入使得产区间距更大。总体来看3个产区样品内部相对集中，组间具备区分性，但仍有错误分类现象，贺兰山东麓产区（HLS）错误分类率最高，其次是新疆产区（XJ）和河西走廊产区（HX）。

图5 元素判别分析得分图（A）元素与同位素判别分析得分图（B）Figure 5 Discriminant analysis score chart based on elements (A) and discriminant analysis score chart based on elements and isotopes (B)

表3 基于元素的LDA判别结果Table 3 LDA discrimination results based on elements

表4 基于元素和同位素的LDA判别结果Table 4 LDA discrimination results based on elements and isotopes

3 讨论与结论

葡萄酒中元素指纹在不同国家和地区均可显示出差异。常量元素Mg是葡萄植株生长必不可少的元素之一，维持酒中pH和离子平衡。不同国家葡萄酒中Mg元素含量存在差异，如在法国葡萄酒中Mg含量为72.5～95.8 mg·L-1[22]；墨西哥葡萄酒Mg的含量为63.9～121 mg·L-1[23]；西班牙里奥哈地区白葡萄酒和红葡萄酒Mg含量分别为69.50～103.88 mg·L-1和47.97～131.69 mg·L-1[24]；美国葡萄酒中Mg含量为135～145 mg·L-1[25]，均低于我国西北地区Mg元素含量。李泽涵等[26]测定新疆葡萄酒中Mg元素的平均含量为143.75 mg·L-1，略低于本研究结果（176.62 mg·L-1）。这些差异可能来自于样品数量、产地及年份等因素。贺兰山东麓产地Mn元素含量位于西北3个产区之首，略高于新疆产区2 mg·L-1，高于其他研究者在该产区得到的结果（0.66～0.72 mg·L-1）[5,10]。元素Rb和Sr的含量与地质岩石特征有较强相关性，并在土壤、葡萄、葡萄汁和葡萄酒中显示出一致性和稳定性，是良好的追溯性指标[27]。除受自然因素影响外，一些外部因素也会影响矿质元素种类和含量。其中大量元素会受有机肥和化肥使用的影响，如有机肥会增加Cu含量，而化肥会增加Mg和Al含量[5]。酿酒技术也会对酒中矿质元素产生不同程度的影响，有研究表明，酿造工艺中浸皮作用影响最大，其次是使用膨润土，但酒中矿质元素指纹组成仍与地理起源相关性更强[28]。

在相近自然环境、土壤条件和酿造技术下，葡萄酒元素指纹信息会显示出相似性，给产地属性判定带来困难。稳定同位素技术应运而生，一些国家已建立数据库用于保护原产地葡萄酒。在法国、意大利、葡萄牙和西班牙葡萄酒中δ13Cgly和δ13Ceth也显示出良好相关性，欧盟数据库中两者均值之差约为-2.3‰[29]。Wu等[15]测定了8个国家葡萄酒中的δ13Cgly和δ13Ceth，两者平均值相差-3.2‰，本研究中二者差值为-5.3‰，均比欧盟统计数据范围更广；8个国家葡萄酒δ18O范围为-5.5‰～4.0‰，该比值变化趋势与地理位置相符，从温暖地区到冷凉地区δ18O逐渐偏负，与本研究结果一致。Rossmann等[30]也证实了这一观点，法国和意大利比德国平均温度高，酒中δ18O更偏正。西北3个产区都处于内陆地区，新疆气温最高，δ18O结果也最为偏正，与河西走廊产区未显示出明显差异。贺兰山东麓产区葡萄酒水中δ18O偏低，可能与大气降水、蒸发量和冲积平原地下水δ18O有关。2010—2012年贺兰山东麓葡萄酒水中δ18O范围在-0.50‰～-0.19‰[31]，比本研究样品（2021—2022年）的变化范围更小（-1.32‰～3.42‰）。罗马尼亚2003年的平均气温高于2004年，δ18O变化范围从2004年的1.89‰到2003年的5.35‰，可以看出δ18O具有一定年份变异性[32]。

在产地鉴别中，不同材料基质应用多元分析均可获得良好结果。意大利威尼斯4个原产地保护区域葡萄酒通过多元素、同位素和化学计量学方法实现了产地鉴别[33]。在西班牙芒果产地判别研究中，应用元素和同位素结合的方法有效提升了模型性能[34]。在海产品、乳制品、肉类等[35-37]产地溯源研究中也均被认可。本研究分析了西北地区葡萄酒中24种元素含量和3种同位素比值，利用多元统计分析方法评估了西北不同产区葡萄酒地理来源。结果表明，Cs、Cu、Li、Mg、Mo、Ni、Pb、Sn、Ti 9种元素及葡萄酒中水的δ18O在3个产区具有显著性差异。元素相关性显示出产地矿质元素指纹信息在不同产区间有明显差异。新疆、贺兰山东麓和河西走廊产区葡萄酒中碳稳定同位素的变化范围小于氧稳定同位素，δ13Cgly、δ13Ceth及δ18O的范围分别为-33.87‰～-28.15‰、-28.69‰～-23.83‰及-1.32‰～8.91‰，其变化主要受地理环境和气候条件影响。在有监督算法中，以同位素为输入变量不能得到良好分类效果，输入变量增加矿质元素后，结果准确率得到有效提高，达95.3%。因此，矿质元素与稳定同位素相结合的多元分析技术在葡萄酒地理评估中具有良好的应用前景，但仍需更多地考虑环境、土壤及酿造加工信息，以期获得更准确的产地溯源结果。