葡萄大小浆果发育前期细胞学、糖积累和库强比较

王乐乐，刘春燕，陈鹏飞，李志慧，王灵哲，周龙*

（新疆农业大学园艺学院/新疆农业大学特色果树研究重点实验室，新疆乌鲁木齐 830052）

葡萄是多年生落叶果树且品种繁多，生殖繁育系统较为复杂，品种间浆果形色各异，而果实大小是进行鲜食葡萄选育和衡量其经济价值的重要指标之一。了解浆果大小形成机理对改善葡萄浆果品质具有重要意义。细胞膨大和增殖是植物果实生长发育的基础，决定细胞的体积和数目，从而影响植物果实大小[1]。葡萄在发育前期细胞分裂和生长与浆果最终大小密切相关，此阶段是决定浆果大小的关键时期，而从转色开始主要以积累内含物质为主[2]。前人通过对梨[3]和甜樱桃[4]果实大小与细胞学方面的研究发现，细胞数量是导致果实大小差异的主导因子；而在菠萝、海棠等果树上的研究发现，除了细胞数量外，导致果实大小差异的主要因素还有细胞体积[5-7]。

糖是植物生命活动的基础物质，具有为果实细胞膨大提供渗透动力的生理功能[8]。研究表明，糖积累与果实大小存在密切关系。吴瑞霞等[9]研究发现，促进糖积累的同时可以提高‘翠冠’梨的果实质量。在南丰蜜梧[10]和温岭高橙[11]果实大小的相关性分析中发现，果实大小与糖度呈负相关关系。而果实中糖积累主要受到蔗糖相关酶活性的调控[12]。浆果作为一个强大的代谢库，在发育过程中需要从源组织获得大量同化物，而获得同化物的能力由库强决定。葡萄是糖直接积累型果树，浆果发育过程中主要以积累蔗糖、果糖和葡萄糖为主[13-14]，高浓度己糖在浆果果肉细胞中积累，能够通过转录和翻译直接或间接调控细胞的活性[15]，从而影响植物器官生长。目前，关于果实大小的研究在多种果树上已有报道，葡萄领域多集中在激素水平的研究，而在细胞水平上的研究较少，影响浆果大小的因子相关性鲜有报道。

本研究以大果型‘户太八号’和小果型‘赤霞珠’葡萄为试材，两品种成熟时平均粒质量分别为7.50～8.50 g和0.70～1.50 g，花期时间相近，且都为有核品种，但浆果质量和体积差异较大。‘户太八号’为‘奥林匹亚’的芽变，于1996年通过审定，口感风味较好，可鲜食也可酿酒；‘赤霞珠’为国际酿酒葡萄品种。通过对决定浆果大小的关键阶段即浆果发育前期细胞水平和生理活性的研究，探讨与浆果大小形成相关的主要因子，从而为浆果大小影响机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年和2022年在乌鲁木齐市头屯河农场新疆农业大学三坪基地（87.32°E、43.89°N）进行。供试材料为6年生‘户太八号’和‘赤霞珠’品种。采用篱架栽培模式，水肥一体化滴灌管理方式，南北行向定植，株行距为1.0 m×3.5 m。

根据对葡萄浆果形态变化的观测，浆果生长进入停滞期前的快速生长阶段是决定浆果最终大小的关键阶段，以此确定采样时期。2021年采样时期为花后10、20、30、40、50 d，测定浆果横径和纵径；2022年除上述采样时期外增加花后15 d采样，之后浆果进入转色期。选取长势基本一致的健康树体不同着生方向的果穗，在果穗上、中、下部位摘取果粒共100粒，所采样品中30粒浸泡在FAA固定液中，30粒用于形态、果实库活性和库强测定，其余浆果样品采后迅速分离果肉用液氮速冻，置于-80 ℃保存，用于浆果主要糖含量和相关酶活性指标的测定。

1.2 试验方法

1.2.1 浆果质量、体积测定和果肉密度计算

用电子天平（0.0001 g）称重得到粒质量，排水法测浆果体积（V）。将10粒新鲜浆果对半切开去除种子，称量果肉质量W0，计算果肉密度ρ为：ρ=W0/V。每个指标重复3次。

1.2.2 浆果细胞数目和体积的测定

参照王艳芳等[16]的方法制作果实石蜡切片，先将FAA中固定好的去除种子的浆果组织置于70%的乙醇溶液中过夜，然后在不同浓度乙醇溶液（依次为80%、90%、95%、100%、100%）中脱水2 h，再依次于体积比分别为2∶1、1∶1、1∶2的乙醇和二甲苯混合溶液中各静置1 h，最后经纯二甲苯浸泡0.5 h（重复2次）进行透明。将透明的样品浸入体积比为1∶1的二甲苯和石蜡混合溶液，于37 ℃恒温箱中过夜，再转入熔解的纯石蜡中，每6 h换一次石蜡溶液，重复5次。接着进行包埋，蜡凝固后成蜡块，进行适当修理后切成10 μm厚度的切片，将切片贴在载玻片上，使用番红固绿染色后用中性树胶封片，最后用尼康显微成像系统镜检拍照，参考田嘉等[17]的方法计算浆果细胞数目和体积。

1.2.3 可溶性固形物和糖含量及相关酶活性的测定

利用糖度计（Atago PAL-1）测定不同发育时期浆果中可溶性固形物含量。称取1.0 g新鲜果肉和果皮混合组织，加蒸馏水研磨成匀浆，沸水煮沸30 min提取浆果组织中的糖，冷却后过滤，残渣再次煮沸10 min后过滤，将滤液全部装入100 mL容量瓶中定容，作为糖提取液备用。浆果中葡萄糖采用GOPOD氧化酶法测定，果糖含量采用间苯二酚法测定，蔗糖含量采用蒽酮比色法测定。总糖为果糖、葡萄糖和蔗糖三者的总和。

蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）和蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）的酶液提取和活性测定参照贺琰等[18]的方法，绘制出酶标准曲线分别为：y=0.0015x+0.0265，r2=0.9938；y=0.0012x-0.0021，r2=0.9903。

1.2.4 浆果库活性和库强计算

将新鲜浆果在60～70 ℃烘至恒重，3个生物学重复（每重复10粒果）。参照张树军[19]的方法计算库活性和库强。库活性以果实相对生长率（Relative growth rate，RGR）表示，RGR=(lnw2-lnw1)/(t2-t1)，w2和w1分别是在时间t2和t1采样时的平均果实干质量（g）。

库强以果实的绝对生长率（Absolute growth rate，AGR）表示，AGR=RGR·w，w为始、末期的干质量w1和w2的平均数。

1.3 数据处理

2021年只检测了浆果纵横径，其他指标均为2022年测定所得。运用SPSS 26.0进行显著性差异及相关性分析，用Excel绘制图，Origin 2021绘制相关性热图。

2 结果与分析

2.1 大小果型葡萄果实质量、体积和果肉密度变化

由表1发现，‘户太八号’浆果在花后40～50 d纵横径无显著差异，‘赤霞珠’纵径在花后30～50 d无显著差异，而横径在花后40～50d无显著差异，说明两品种分别在花后40 d和30 d进入缓慢生长期，花后50 d浆果开始转色。花后10～20 d浆果表型变化较大，因此2022年增加在花后15 d的取样。

表1 2021年‘户太八号’和‘赤霞珠’葡萄品种的浆果生长变化Table 1 Changes of berries growth of grape varieties with 'Hutai No.8' and'Cabernet Sauvignon' in 2021 mm

‘户太八号’和‘赤霞珠’葡萄品种在浆果快速生长阶段随着浆果生长期的延长，粒质量和体积均呈显著增长，但增加幅度在品种间有较大差异（图1、2）。在花后15 d前，两品种葡萄粒质量和体积差异较小，之后变大；至花后50 d，‘户太八号’和‘赤霞珠’的粒质量分别为7.17、0.81 g，体积分别为7.0、0.8 mL，此时，‘户太八号’的粒质量和体积分别是‘赤霞珠’的8.85倍和8.75倍；且在花后15～50 d期间，‘户太八号’浆果的生长速率为0.18，显著大于‘赤霞珠’。两品种粒质量均在40 d和50 d时期无显著差异，这阶段浆果生长缓慢，进入生长停滞期。两品种的浆果果肉密度（图2）相近均呈较为平稳的变化趋势，仅在花后10 d有较大差异，表现为‘赤霞珠’的果肉密度大于‘户太八号’。

图1 ‘户太八号’和‘赤霞珠’葡萄果实粒质量变化Figure 1 Dynamic map of berry weight of 'Hutai No.8' and'Cabernet Sauvignon' varieties

图2 ‘户太八号’和‘赤霞珠’果实体积和果肉密度动态变化Figure 2 Dynamic changes of single fruit volume and flesh density of 'Hutai No.8' and 'Cabernet Sauvignon'

2.2 大小果型葡萄果实细胞数目和体积变化

对浆果细胞显微结构观测（图3）发现，不同品种随着浆果发育，果肉细胞表现为持续膨大，但‘户太八号’浆果细胞的横截面积（CS）和纵截面积（LS）均大于‘赤霞珠’。两品种浆果单位面积细胞数目和细胞体积在浆果发育各时期差异均显著。在细胞数目方面，‘户太八号’的细胞数目增长过程主要在花后10～30 d，随后细胞数目逐渐平稳；而‘赤霞珠’细胞数目在10～50 d变化不大（图4）。从细胞体积变化来看，两品种细胞膨大呈一致的上升趋势，而花后10 d两品种细胞体积基本相同，均为2×10-4mm3，之后各时期‘户太八号’浆果细胞体积明显大于‘赤霞珠’，在花后40 d和50 d时差异最大（图4），推断‘户太八号’的细胞膨大能力大于‘赤霞珠’。细胞数目和体积也是决定库大小的主要因素，两品种之间细胞数目的差异大于细胞体积，说明‘户太八号’和‘赤霞珠’在库大小上差异的主要因子是细胞数目。

图3 ‘户太八号’和‘赤霞珠’果实发育进程中果肉细胞横切面和纵切面Figure 3 Cross and longitudinal sections of pulp cells of 'Hutai No.8' and 'Cabernet Sauvignon' during berry development

图4 ‘户太八号’和‘赤霞珠’果实细胞数目和体积动态变化Figure 4 Dynamic changes of cell number and volume of 'Hutai No.8' and 'Cabernet Sauvignon' berries

2.3 大小果型葡萄果实中可溶性固形物含量

‘户太八号’和‘赤霞珠’浆果中可溶性固形物含量均随着浆果发育呈上升趋势，在花后15～30 d‘赤霞珠’高于‘户太八号’，而花后40 d和50 d‘户太八号’高于‘赤霞珠’（图5）。

图5 ‘户太八号’和‘赤霞珠’果实中可溶性固形物含量变化Figure 5 Changes of soluble solids content of 'Hutai No.8' and'Cabernet Sauvignon' berries

2.4 大小果型品种果实中主要糖组分的含量变化

由图6看出，两品种总糖含量变化趋势在花后10～30 d存在差异，之后变化趋势一致，仅在花后15 d时‘赤霞珠’浆果中总糖含量高于‘户太八号’，其他各时期均为‘户太八号’浆果中总糖含量高于‘赤霞珠’。两品种果实葡萄糖含量的变化趋势基本一致，从花后20 d开始上升，且随着浆果发育‘户太八号’浆果中葡萄糖含量高于‘赤霞珠’。图6显示，两品种浆果中果糖含量均呈先降后增再降的趋势，均在花后10 d果糖含量最高，分别是19.65、11.67 mg·g-1；除花后15 d外，其他各时期‘户太八号’均高于‘赤霞珠’。浆果中蔗糖含量均在花后10～15 d阶段增幅最大，20～40 d阶段蔗糖含量变化比较平稳，随后又明显上升，至花后50 d时分别为14.30、12.03 mg·g-1；花后15 d前表现为‘赤霞珠’浆果中蔗糖含量高于‘户太八号’，之后‘户太八号’浆果高于‘赤霞珠’。

图6 ‘户太八号’和‘赤霞珠’果实中主要糖组分的含量变化Figure 6 Changes of the main sugar components content of 'Hutai No.8' and 'Cabernet Sauvignon' berries

2.5 大小果型葡萄果实中蔗糖相关酶活性变化

由图7可知，浆果中蔗糖合成酶（SS）活性随发育期呈不同的波动趋势，‘户太八号’浆果在花后15～20 d有一个短期的SS活性下降，‘赤霞珠’浆果中SS活性整体变化较小。从花后30 d开始，‘户太八号’浆果中SS活性均高于‘赤霞珠’，在花后50 d时两品种浆果中SS活性差异最大，分别是188.22、113.54 U·g-1，此时‘户太八号’浆果中SS活性是‘赤霞珠’的1.7倍。

图7 ‘户太八号’和‘赤霞珠’果实中蔗糖相关酶活性变化Figure 7 Changes of sucrose-related enzyme activities in 'Hutai No.8' and 'Cabernet Sauvignon' berries

‘户太八号’和‘赤霞珠’浆果中蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性的变化趋势在花后10～20 d存在明显差异，之后均呈上升趋势（图7），且在此阶段‘赤霞珠’浆果中SPS活性增幅大于‘户太八号’浆果。但总体来看两品种浆果中SPS活性都有一个明显降低的时期，‘户太八号’是花后15～20 d，‘赤霞珠’是花后10～15 d，其它各时期均上升。

2.6 大小果型葡萄果实库活性和库强变化

图8表明，‘户太八号’和‘赤霞珠’浆果的库活性RGR（以相对生长率表示）相比，在花后15 d时差异最大，‘户太八号’浆果的RGR是‘赤霞珠’浆果的4倍，其他各时期两者差异不大。两品种浆果的RGR分别在花后15 d和20 d开始随着浆果发育逐渐下降。从浆果的库强AGR（以绝对生长率表示）看（图8），‘户太八号’总体变化波动较大，而‘赤霞珠’各时期变化不明显。两品种浆果的AGR相比较，仅花后10 d时AGR大小基本相同，其他各时期‘户太八号’浆果的AGR显著大于‘赤霞珠’，差异最明显的是在花后40 d时。由此说明，葡萄品种之间对果型大小差异影响较大的为AGR。

图8 ‘户太八号’和‘赤霞珠’果实的相对生长率和绝对生长率变化Figure 8 Changes of relative growth rate and absolute growth rate of 'Hutai No.8' and 'Cabernet Sauvignon' berries

2.7 浆果大小与细胞生长、库强和糖积累指标的相关性分析

由图9可知，‘户太八号’粒质量（SFW）与SS活性、蔗糖含量（SC）、葡萄糖含量（GC）、可溶性固形物（SSC）、细胞数目（CN）、细胞体积（CV）和果肉密度（FD）、单果体积（SFV）极显著正相关，与总糖含量（TSC）和AGR显著正相关，与RGR极显著负相关，而与果糖（FC）含量和SPS活性相关性不大。其中粒质量与SFV、CN、CV和SSC的相关系数最高，分别为1.00、0.96、0.97和0.92。‘赤霞珠’粒质量与SFV、SSC、CN和CV极显著正相关，与蔗糖含量显著正相关，与果糖含量和RGR极显著负相关，而与果肉密度、葡萄糖含量、TSC、SS活性、SPS活性和AGR相关性不大。其中与细胞体积和RGR相关性最高，相关系数分别为0.99和-0.88。

图9 ‘户太八号’和‘赤霞珠’浆果大小与细胞生长、库活力和糖积累指标的相关性分析Figure 9 Correlation analysis of berry size with cell growth, sink activity and sugar accumulation in 'Hutai No.8' and 'Cabernet Sauvignon'

关于糖含量和蔗糖代谢相关酶活性的相关性，‘户太八号’中SS活性与葡萄糖、蔗糖含量呈极显著正相关，与总糖含量显著正相关，与果糖含量无显著相关性，而SPS活性与糖含量指标均无显著相关性。‘赤霞珠’中糖含量与蔗糖代谢相关酶活性相关性都不高（图9）。

‘户太八号’的细胞数目与SS活性、蔗糖含量、SSC和细胞体积极显著正相关，与AGR和葡萄糖含量显著正相关；细胞体积与SS活性、总糖、蔗糖、SSC和葡萄糖含量极显著正相关；细胞数目和细胞体积与RGR均极显著负相关；细胞数目与SS活性、SSC和细胞体积相关性最高，相关系数分别为0.84、0.82和0.90；细胞体积与SS活性和SSC相关性最高，相关系数分别是0.85和0.95（图9）。‘赤霞珠’的细胞数目只与AGR和SSC极显著正相关，与细胞体积显著正相关，而与果糖含量极显著负相关，与总糖含量显著负相关；细胞体积只与SSC极显著正相关，与蔗糖显著正相关，而与RGR极显著负相关，与果糖显著负相关（图9）。

3 讨论与结论

3.1 果型大小与细胞生长的关系

果实细胞的数目和体积是影响果实最终大小的关键因子，且不同品种间细胞数目和体积存在明显差异。本研究相关分析结果表明，两品种的浆果大小（粒质量和体积）与果肉细胞数目和体积均呈极显著正相关关系，由此可知，细胞数目和体积共同影响葡萄浆果大小，这与在菠萝[6]和苹果[7]上的研究结果一致，即细胞数目和体积共同决定果实大小。一般认为细胞数目是决定果实大小的基础，而细胞体积是影响最终果实大小的关键。研究发现，‘户太八号’的细胞数目和体积均大于‘赤霞珠’，且两品种间的细胞数目比细胞体积差异更显著，这与不同梨品种间和甜樱桃品种间的研究结果一致，品种间果实大小的差异主要体现在细胞数目上[3-4]。这说明‘户太八号’和‘赤霞珠’之间浆果大小差异主要因子是细胞数目。

3.2 果型大小与主要糖组分的关系

本研究中，在浆果发育前期‘户太八号’浆果中总糖含量高于‘赤霞珠’，其中蔗糖含量相近，葡萄糖和果糖含量相差较大，为‘户太八号’高于‘赤霞珠’。‘户太八号’浆果大小与蔗糖和葡萄糖存在极显著正相关关系。‘赤霞珠’粒质量与蔗糖含量呈显著正相关，与果糖呈极显著负相关。沈志军等[20]对桃果实与主要糖含量关系的研究表明，桃果实大小与蔗糖含量显著正相关，这与本研究结果一致。此外，谢鸣等[21]研究杨梅果实发育过程中的糖积累及其相关性的结果表明，杨梅果实大小与蔗糖、葡萄糖和果糖的积累呈极显著正相关关系。以上研究说明果实大小与主要糖含量密切相关。然而，在不同果树和不同品种之间果实大小与各糖组分的相关关系存在差异，可见果实大小与糖积累的关系较为复杂，因品种本身果实发育特性不同，或果树间生长条件不同，环境因子又能有效调控糖的运输、代谢与积累[22]，这导致不同品种果实糖积累的各组分含量不同。关于糖能够影响果实大小的研究发现，糖是植物生长发育的基础物质，可作为信号分子联合激素信号和N信号等形成网络，通过信号转导途径调控植物生长发育[23]，从而影响果实大小。

3.3 果型大小与库活力和库强的关系

果树产量和果实品质依赖其源库互作关系，有研究认为，源库关系对果实大小的影响大于对果实其他品质的影响[24]。库即消耗或容纳光合同化物的器官，果实库是源库研究的主要器官，库器官竞争光合同化物的能力用库强表示[25]。本研究中，浆果发育前期‘户太八号’和‘赤霞珠’间浆果的库活性和库强相比，品种间浆果库强的差异显著大于库活性，且‘户太八号’各时期的库强一直大于‘赤霞珠’，这与李建国等[26]在大果型‘鹅蛋荔’和小果型‘淮荔’上的研究结果一致，‘鹅蛋荔’的库强大于‘淮荔’。研究表明，库强较大的果实生长速率较快且代谢旺盛，果实（库器官）竞争同化物的能力强，则得到的光合同化物较多，从而表现为果实大小的差异[19]。因此，说明库强大小影响品种间浆果大小，也表明浆果发育前期‘户太八号’对光合同化物竞争能力比‘赤霞珠’强，浆果生长速率大于‘赤霞珠’，从而导致品种间最终浆果大小差异。

综上所述，果实的生长发育是一个较为复杂的过程，影响最终果实大小的因素很多。本研究在对浆果发育前期的研究结果发现，‘户太八号’的浆果大小与库强、糖合成酶活性、总糖含量、蔗糖含量、葡萄糖含量、可溶性固形物、细胞数目、细胞体积和果肉密度显著正相关，与库活性显著负相关，与可溶性固形物、细胞数目和细胞体积的相关性最强。‘赤霞珠’的浆果大小与蔗糖含量、可溶性固形物、细胞数目和细胞体积显著正相关，与库活性和果糖含量显著负相关，与细胞体积的相关性最强。可见上述因子可能直接或间接影响着浆果大小，且两品种之间与浆果大小的相关因子存在显著差异。同时发现，细胞生长、糖积累和库强之间同样存在显著的相关关系，说明细胞水平与果实内在品质之间通过相互影响与相互作用，形成一个复杂的浆果大小调控网络，但其具体的调控机理还有待进一步研究。