‘北玫’‘北全’葡萄果实中酚类物质比较

邵洁玲，单守明，马军，雷昊，李亚川，刘成敏*

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

酚类物质是酿酒葡萄果实中重要的功能成分，由一系列次生代谢产物构成，受葡萄品种、栽培条件和成熟度等因素影响[1]。葡萄果实中的酚类物质及其衍生物按其化学结构主要有：黄烷醇类、酚酸类、黄酮醇类和芪类等[2-3]，其中黄烷醇类结构主要为C2和C3之间的链上有饱和苯并吡喃类化合物，且在C3位置上有羟基，赋予葡萄酒风味和口感[4]；酚酸类物质主要以七碳原子（C6-C1）和九碳原子（C6-C3）结构存在于葡萄果实中，形式多样，一般可作为辅色物质[5-6]；黄酮醇类物质的特征是在C2和C3原子之间存在双键，并在C3上存在羟基，对葡萄和葡萄酒的颜色具有重要作用[7]。此外，芪类物质的特征为二苯乙烯母核或其聚合物，在植物生长发育过程中可产生一些次生代谢产物，如白藜芦醇，是葡萄中对人体健康有益的物质[8-9]。这些酚类物质的结构和功能对增强葡萄酒的营养价值具有重要意义。

葡萄品种特性是影响果实酚类物质合成的重要因素之一。因其自身结构属性不同，从而使酚类物质在果实中的表现有所差异[10]。孙树霖等[11]通过对3种红色酿酒葡萄果实酚类物质比较认为，品种不同，酚类物质含量差异明显；王舒伟等[12]探讨了成熟度对‘赤霞珠’葡萄酒酚类物质的影响，结果表明，随着葡萄成熟度的上升，葡萄酒中黄酮醇和黄烷-3-醇含量呈现下降趋势。宁夏贺兰山东麓产区因其特殊的地理位置，被业界称为优质产区，‘北玫’和‘北全’欧山杂种目前在该产区栽培表现良好[13-15]，但对其葡萄果实中酚类物质研究还不够深入。

因此，基于超高效液相色谱（UPLC）技术，以‘北玫’和‘北全’为试材，研究葡萄果实成熟过程中单体酚物质的积累规律，明确和比较不同品种酚类物质差异，以期为产区葡萄品种调整，丰富葡萄酒市场提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验于2020年在宁夏银川平吉堡“宁夏现代农业综合开发工程技术研究”酿酒葡萄示范园进行（38°24′N，106°01′E）。试验地位于银川平原引黄灌区中部，年降水量170～200 mm，无霜期160 d左右，沙质土壤。供试材料‘北玫’和‘北全’为欧山杂种，晚熟，7年生，在贺兰山东麓地区可不埋土越冬，“厂”形树形，管理方式基本一致。

试验中所用没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、芦丁、儿茶素没食子酸酯、阿魏酸、柚皮苷、苯甲酸、杨梅素、水杨酸、白藜芦醇、桑色素、槲皮素、山奈酚标准品均为色谱纯，购自美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

分别对葡萄果实转色初期、转色盛期、成熟期和采收期取样。于2020年7月12日（转色初期，S1）选取长势一致的葡萄树（各10株），每株树体阴阳面各选择1穗果，共计20穗。其余时期取样时间为2020年8月11日（转色盛期，S2）、2020年9月12日（成熟期，S3）、2020年10月3日（采收期，S4），每次从标记好的果穗上、中、下部位采果粒，每个品种共计120粒，混匀后，液氮速冻，存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 果实酚类指标测定

单宁含量采用福林-丹尼斯法测定；总酚含量采用福林酚试剂比色法测定；花色苷含量以pH示差法测定。

1.2.3 单体酚含量测定

果实单体酚的提取参照刘迪迪等[16]的方案略有改动。称取2.0 g果实粉末，加入提取液（5 mL蒸馏水和45 mL乙酸乙酯），置于摇床（30 ℃、170 r·min-1）避光提取30 min，重复3次，收集上清液于茄形瓶中，用旋转蒸发仪蒸干（33 ℃），残渣用2 mL色谱甲醇溶洗，用0.45 μm的滤膜过滤后备用。全程避光操作，每个样品3个生物学重复。

色谱分析：使用LC-20A岛津超快速液相色谱仪配有SPD二极管阵列检测器对样品进行定性定量检测，色谱条件为波长280 nm，柱温30 ℃，进样量5 μL。流动相A：5%甲醇+0.1%甲酸+水，流动相B：5%乙腈+0.1%甲酸+甲醇，流速为1.0 mL·min-1。洗脱程序：0～8 min，10% B；8～30 min，10%～30% B；30～35 min，30%B；35～45 min，30%～40% B；45～50 min，40%～50%B；50～52 min，50%～100% B；52～54 min，100%B；54 min，100%～10% B；54～60 min，10% B。根据标准品的保留时间定性单体酚成分，标准曲线进行定量，单位用mg·kg-1表示。

1.3 数据分析

采用Excel 2016数据整理和制表，IBM SPSS Statistics 27进行主成分分析（PCA）和单因素方差分析（One-way ANOVA），LSD法进行多重比较（P＜0.05），通过Origin 2021和SIMCA软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 两品种果实酚类物质分析

由表1可知，‘北玫’转色初期单宁含量最高，整个时期两品种单宁变化趋势一致，呈先下降后上升趋势，且采收期两个品种含量差异不显著。‘北玫’和‘北全’花色苷均在成熟期快速上升，之后积累缓慢并达到最大值，分别为2.91、2.94 mg·g-1。总酚含量中‘北玫’成熟时达到最大值，之后逐渐下降；而‘北全’在转色初期总酚含量最大，呈先降后升趋势，采收期高于‘北玫’。

表1 葡萄果实单宁、花色苷、总酚含量变化Table 1 Changes of tannin, anthocyanin and total phenol contents in grape fruits mg·g-1

2.2 两品种果实单体酚类物质含量分析

2.2.1 两品种黄烷醇类物质含量差异分析

如图1A所示，‘北玫’和‘北全’品种果实中共检测出4种黄烷醇类物质，儿茶素含量最高，随着果实发育呈先上升后下降的趋势，采收期‘北全’含量显著高于‘北玫’，是‘北玫’的1.25倍，并且儿茶素含量分别占黄烷醇总量的80.35%和84.14%。整个发育时期来看，‘北玫’葡萄成熟过程中表没食子儿茶素没食子酸酯表现最差，且显著低于‘北全’，采收时其含量仅为8.74 mg·kg-1。同时‘北玫’和‘北全’黄烷醇当中均是表儿茶素随着成熟度增加呈现先增后降,而儿茶素没食子酸酯则是逐渐增加,在成熟期达到最大值。

图1 葡萄果实不同黄烷醇类化合物含量（A）及总量（B）分布Figure 1 Distribution of different flavanols content (A) and total content (B) in fruit

由图1B所示，果实成熟过程中两个品种黄烷醇含量呈先上升后下降的趋势。整个成熟时期来看，转色初期，两品种黄烷醇含量最低；采收期‘北全’含量显著高于北玫，‘北全’含量为739.79 mg·kg-1，是‘北玫’的1.18倍。两个品种均是在成熟期达到最大值，但‘北全’黄烷醇化合物积累变化幅度相较于‘北玫’表现缓慢。

2.2.2 两品种酚酸类含量差异分析

如图2A所示，共检测出6种酚酸类物质，含量最多的为绿原酸，随着果实成熟，‘北玫’和‘北全’中均表现出先上升后下降的趋势，其含量分别占酚酸总量的69.32%和67.09%；采收时期，‘北全’绿原酸含量高于‘北玫’，为201.13 mg·kg-1。整个发育时期来看，‘北全’葡萄成熟过程中水杨酸表现最差，采收时仅为0.41 mg·kg-1。另外，咖啡酸含量居第二位，两品种均在转色盛期达到最高值，再逐渐缓慢下降，没食子酸、阿魏酸、苯甲酸果实成熟过程中积累规律接近，呈先升后降的趋势。

图2 葡萄果实不同酚酸类化合物含量（A）及总量（B）分布Figure 2 Distribution of different phenolic acids content(A) and total content(B) in fruit

由图2B所知，酚酸总量和黄烷醇总量物质积累变化趋势相似。转色初期时，两品种酚酸总量最低，‘北玫’在转色盛期达到最高值，之后逐渐下降，采收期为265.44 mg·kg-1；而‘北全’在成熟期达到最高值，之后逐渐下降，采收期显著高于‘北玫’，为‘北玫’的1.13倍。

2.2.3 不同品种黄酮醇类含量差异分析

如图3A所示，北玫’和‘北全’共检测出6种黄酮醇类化合物，且均是芦丁含量最高，果实成熟过程均表现上升趋势，采收时含量分别为19.08、27.74 mg·kg-1，分别占黄酮醇类总量的51.59%、55.48%。同时，其余黄酮醇类组分均呈逐渐上升趋势，柚皮苷为‘北全’独有。

由图3B所示，果实成熟过程中黄酮醇类总量呈逐渐上升的趋势，成熟期至采收期‘北全’比‘北玫’上升快。两品种均于采收期达到最大值，分别为37.78、50.04 mg·kg-1。

2.2.4 两品种白藜芦醇含量差异分析

如图4所示，整个成熟过程中‘北玫’和‘北全’中白藜芦醇含量呈先上升后下降的趋势。各时期来看，转色初期和转色盛期‘北玫’高于‘北全’；而成熟期和采收期与之相反，‘北全’高于‘北玫’。采收时‘北全’含量为0.61 mg·kg-1，为‘北玫’的2.77倍。此外，两品种白藜芦醇均是先快速上升在成熟期达到最

高值，之后快速下降。

2.3 两品种酚类物质主成分分析和差异物质筛选

为了探究两品种葡萄果实中酚类物质含量的差异，对采收期果实酚类物质进行主成分分析，分别对两品种单体酚提取2个主成分（PC）。由图5可知，非花色苷类酚含量指标的PC1和PC2分别为85.73%和7.69%，累计方差贡献率为93.42%。两品种的果实酚类物质含量分离明显，且从挥发性成分的变量因子和个体品种的分布来看，不同挥发性成分对不同品种果实的贡献有所差异。

图5 主成分分析Figure 5 PCA analysis

‘北玫’位于第二象限，结合各指标矢量分布儿茶素没食子酸酯、桑色素、杨梅素较‘北全’差异显著。‘北全’位于第一象限，结合矢量分布来看，儿茶素、芦丁、白藜芦醇、没食子酸、柚皮苷、阿魏酸较‘北玫’差异性显著。

为进一步分析两品种果实中单体酚物质差异，利用果实中单体酚含量数据进行正交偏最小二乘判别（OPLS-DA）分析。由图6所示，该模型可以清晰的将两品种区分，模型的R2x、R2y和Q2值分别为0.979、0.999和0.996，表明结果较好。采用变量重要性投影值（Variable importance in projection，VIP）筛选两品种果实中单体酚化合物的特征差异（图7），其中VIP值大于1的物质是体现样品间差异的主要成分。共筛选出5个VIP＞1的物质，按贡献度从高到低依次为儿茶素、儿茶素没食子酸酯、绿原酸、表儿茶素、柚皮苷。

图6 两品种OPLS-DA模型得分图Figure 6 Score of OPLS-DA model for two varieties

图7 OPLS-DA模型中出峰的VIP值Figure 7 VIP value of indicators in OPLS-DA model

3 讨论与结论

宁夏贺兰山东麓是我国葡萄种植优质产区，冬季寒冷干燥，低温持续时间长，该产区主栽的欧亚种葡萄对极端低温的耐受性较差，而冬季埋土防寒不仅加速了树体的老化和死亡，而且使劳动力成本不断升高，成为提高葡萄尤其是葡萄酒生产成本的主要原因，因此免埋土葡萄品种的选择是该区域的重要研究课题。葡萄采收期的确定将直接影响葡萄果实的品质和酚类物质含量，进而对葡萄酒的品质产生不同程度的影响。因此，通过了解葡萄原料的多酚物质，进而科学地判断葡萄果实的成熟度及最佳采收期至关重要[17-20]。

酚类化合物是体现葡萄果实品质的重要物质，且葡萄酒的风味和品质与酚类物质有较强的关联度[21-22]。本研究发现，‘北玫’和‘北全’两品种成熟期间单宁和花色苷的积累趋势接近，单宁呈先降后升趋势，花色苷随着成熟逐渐升高，与前人研究一致[23]，总酚含量积累趋势两者有所不同，其中采收期总酚、单宁和花色苷含量无显著差异。

酚类物质是葡萄生长发育过程中重要的次生代谢产物，可以体现葡萄果实品质，并且具有一定的抗氧化性[25]，葡萄果实中黄烷醇类化合物主要分布于种子和果皮中，占葡萄总酚含量的13%～30%。单体酚类主要体现在黄烷醇上，且在种间存在差异[23,26]。本试验中两个品种在采收期黄烷醇、酚酸、黄酮醇类化合物总量差异显著，均是‘北全’高于‘北玫’，分别是1.18倍、1.13倍和1.32倍，其主要成分为儿茶素、绿原酸和芦丁，这与前人研究较为一致[23]；白藜芦醇含量在成熟期达到最高值，且在‘北全’中高于‘北玫’。本研究应用主成分分析法和正交偏最小二乘判别分析法结合采收期葡萄果实的17个单体酚含量进行差异分析和筛选，其中儿茶素没食子酸酯、桑色素、杨梅素为‘北玫’主要特征物质；儿茶素、芦丁、白藜芦醇、没食子酸、柚皮苷、阿魏酸为‘北全’主要特征物质。进一步筛选出黄烷醇类化合物为主要差异物质，与前人研究结果一致[27]。此外，白藜芦醇指标成熟过程中，成熟期至采收期含量快速下降与前人研究有所不同，这可能与品种和地方表现相关。

综上所述，两个酿酒葡萄品种的酚类物质含量存在差异，黄烷醇类含量最高，酚酸类次之，黄酮醇和芪类含量较低。其中采收期黄烷醇、酚酸、黄酮醇类化合物总量差异显著，均是‘北全’高于‘北玫’，其主要成分分别为儿茶素、绿原酸和芦丁。结合统计学方法分析，初步确定‘北全’较‘北玫’发展潜力更充分。