葡萄炭疽病病原菌的分离鉴定及防控药剂筛选

张新龙，张国福，杨素梅，金岩，张耀中，范昆，付丽*

（1.山东省阳谷县农业农村局，山东阳谷 252300；2.山东省农药检定所，山东济南 250131；3.山东省果树研究所，山东泰安 271000）

葡萄炭疽病又名晚腐病、苦腐病，主要危害果实，同时也危害穗轴、叶片、叶柄和新梢等部位。该病害是葡萄种植区内普遍存在的真菌性病害，多发生在果实近成熟期，严重影响果实品质和产量[1-2]。目前国内报道的葡萄炭疽病致病菌种大多为胶孢炭疽菌（Collectotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）[3-7]。2015年Yan等[8]对北京、河北、河南和山东采集的34株葡萄炭疽病样本进行分离鉴定，又发现了葡萄炭疽菌（Colletotrichum viniferum）、隐秘刺盘孢（Colletotrichum aenigma）、果生刺盘孢（Colletotrichum fructicola）和Colletotrichum hebeiense，并指出葡萄炭疽菌（C.viniferum）是致病力较强的菌种，由该菌引起的病害发展速度快，是需要重点检测及防控的菌种。随后，刘梅等[9]在2018年发现，C.viniferum已经是北京地区葡萄炭疽病菌的优势菌种，分离率为90.3%。谭海芸等[10]对广西南宁的葡萄炭疽病病原菌进行鉴定发现，C.viniferum为主要致病菌种。许媛等[11]对江苏句容的葡萄炭疽病病原菌进行鉴定，C.viniferum的分离率为31.37%，且对苯并咪唑类杀菌剂产生中高抗性。因此，筛选C.viniferum的有效防治药剂迫在眉睫。

本研究选择戊唑醇、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咪鲜胺、二氰蒽醌、代森锰锌6种杀菌剂，通过测定其对C.viniferum菌丝生长的毒力，并在历年葡萄炭疽病发生严重的果园进行田间药剂防治试验，以期筛选防治葡萄炭疽病的高效杀菌剂。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

试验于2022年8月在山东省泰安市宁阳县蒋集镇石门庄彩山百果园（35°54′21″N，117°15′33″E）进行，葡萄品种为‘巨峰’‘红地球’‘夏黑’‘巨玫瑰’等，其中‘红地球’葡萄的炭疽病发病严重。本试验采集‘红地球’葡萄具有典型症状的病果进行菌种分离纯化。

培养基：PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，水1000 mL）用于炭疽菌菌株的分离、保存及鉴定。

药剂及试剂：97%苯醚甲环唑原药、430 g·L-1戊唑醇悬浮剂，山东省联合农药工业有限公司；98%咪鲜胺锰盐原药、97%戊唑醇原药、90%代森锰锌原药，山东潍坊润丰化工股份有限公司；98%吡唑醚菌酯原药，山东海利尔化工有限公司；95%二氰蒽醌原药、22.7%二氰蒽醌悬浮剂，江西禾益化工股份有限公司；10%苯醚甲环唑水分散粒剂，山东富润实生物科技有限公司；450 g·L-1咪鲜胺水乳剂，山东禾宜生物科技有限公司；25%吡唑醚菌酯悬浮剂，山东胜邦绿野化学有限公司；80%代森锰锌可湿性粉剂，山东澳得利化工有限公司。

原药以丙酮溶解，制备成浓度为1×105mg·L-1的母液，于4 ℃保存备用。

主要仪器：人工气候箱（RXZ-380），宁波江南仪器厂；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LB-100SII），上海博讯实业有限公司；光学显微镜（Axio Scope A1），蔡司光学；PCR仪（EppendorfMastercycler X50l），德国Eppendorf公司；琼脂糖水平凝胶电泳仪（DYCP-32C），北京六一仪器厂；凝胶成像分析系统（JS-2000），上海培清科技有限公司；16 L手动气压背负式农药喷雾器，山东省淄博华岳环保设备有限公司。

1.2 病原菌的分离纯化及形态鉴定

将病果洗净晾干，在超净工作台上用手术刀从病健交界处切取约0.5 cm2的组织块，75%乙醇消毒30 s后，再用1%次氯酸钠溶液消毒10 s，无菌水漂洗3次，最后用灭菌滤纸吸干多余水分，接种于PDA培养基中央，25 ℃恒温培养箱中倒置培养5 d，待菌丝长出后通过挑取菌丝尖端进行多次纯化。将各病原菌分离物的纯化菌株置于PDA培养基上，25 ℃条件下培养，7 d后观察在PDA培养基上的菌落形态、大小、色素分泌、产孢情况等性状，并挑取少许菌体在光学显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗等的形态。将形态鉴定后的病原菌编号。

根据柯赫氏法则[12]，用无菌水冲洗菌丝，配成孢子浓度约为1×105cfu·mL-1的悬浮液，用针刺法接种到健康的‘红地球’葡萄果粒上，以清水作对照。25 ℃条件下18 h光照6 h黑暗交替处理，湿度保持在90%下培养，5 d后调查发病情况。对发病果粒重新进行组织分离和单孢纯化，获得纯培养物并与原接种菌株进行比较。

1.3 分子生物学鉴定

采用CTAB法提取病原菌基因组DNA[9]，以ITS通用引物（ITS1/ITS4）进行PCR扩增。PCR 扩增体系（25 μL）：PCR mix 12.5 μL、上下游引物（10 μmol）各1 μL、DNA模板1 μL，加ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸3 min。于4 ℃保存。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果在DNAMAN软件中拼接后提交到GenBank进行比对，下载相关炭疽菌属菌株的相应序列，采用Clustal X对序列进行比对分析，并利用MEGA11.0软件中的邻接法构建系统发育树（NJ树），确定菌株的种类。

1.4 室内毒力测定

在预试验的基础上，对供试药剂母液进行梯度稀释。苯醚甲环唑、戊唑醇的试验终浓度为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg·L-1，吡唑醚菌酯、咪鲜胺试验终浓度为8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 mg·L-1，二氰蒽醌试验终浓度为40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg·L-1，代森锰锌试验终浓度为200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg·L-1。

葡萄炭疽病菌的室内毒力测定采用生长速率法。取1 mL各浓度药液（50倍于终浓度）加入49 mL灭菌的50 ℃的PDA培养基中，摇匀后倾倒至直径9 cm的灭菌培养皿中，制成含药平板。在活化好的葡萄炭疽病菌菌落边缘，以直径7 mm的打孔器打取菌饼，菌丝面朝下接种至平板上。以无菌水代替药液为对照，每个平板为1个重复，每处理重复4次。25 ℃黑暗培养，待对照菌落长至培养皿2/3左右时，采用十字交叉法测量各处理菌落直径，计算各处理的菌丝生长抑制率。

1.5 田间防效试验

田间试验于2022年在山东省泰安市宁阳县蒋集镇石门庄彩山百果园‘红地球’葡萄上进行，树龄15年。于葡萄花后每隔10 d即5月23日、6月2日和6月12日进行喷雾施药，第3次药后当天完成果实套袋。根据各药剂在中国农药信息网上的标签信息确定施用浓度，施药液量以叶片、果面均匀着药、并稍有药液下滴为度，药液量约为1500 L·hm-2。每8株树为1个小区，每个处理重复4次，随机区组排列。

于果实近成熟期8月12日解袋调查发病情况。每小区随机选取不同部位果穗100个，调查记录每个果穗的总果粒数和病果粒数。

按下列公式计算药剂防效：

病果率（%）=(病果粒数/调查总果粒数)×100

防治效果（%）=(对照病果率-处理病果率)/对照病果率×100

1.6 数据分析

采用DPS软件进行数据统计分析，以药剂浓度对数作为横坐标，以抑制率转换为几率值作为纵坐标，求相关系数、毒力回归方程，从而计算各种供试药剂对病原菌的50%有效浓度（EC50）、95%最大有效浓度（EC95）及95%置信区间。采用Duncan's新复极差法进行处理间数据的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄炭疽病病原菌分离及致病性测定

葡萄炭疽病菌在生长后期，果实着色成熟时发病，主要危害果实，也能侵染叶片、新梢、果梗等其他部位。发病最初在果面产生针头大小的褐色圆斑，病斑逐渐扩大并稍有凹陷，果肉变软腐烂，表面产生轮纹状排列的小黑点，为病原菌的分生孢子器。病害侵染后期，病斑中央有粉红色粘状物，即分生孢子团。发病严重时，病斑可扩展到整个果面乃至全穗。

从葡萄炭疽病果共分离得到36株真菌，去除葡萄白腐病菌、灰霉病菌、黑曲霉菌等非炭疽病菌，根据菌落形态、颜色、菌丝形态等特征，对其中形态相似的10株菌株编号（PTTJ 024-033），选取PTTJ 033进行后续试验，纯化后在PDA培养基平板生长的菌落形态如图1所示。菌落正面灰白色，呈棉絮状，背面淡橘黄色，气生菌丝致密，生长速度为5.5～6.8 mm·d-1。培养后期中央散生粉红色黏状分生孢子团，后期背面变黑色。分生孢子单孢、无色、圆柱形，有时具油球，大小为13.22 μm×4.68 μm（图2），根据形态学初步鉴定为C.viniferum。将纯化后的病原菌孢子液回接至‘红地球’葡萄果实上（图3），与原始症状相同。

图1 Colletotrichum viniferum在PDA平板上的形态学特征（PTTJ033）Figure 1 Morphological characteristics of Colletotrichum viniferum (PTTJ033) growing on PDA

图3 C.viniferum（PTTJ033）接种离体果实5 d后的发病情况Figure 3 Disease incidence within five days after vaccination of C.viniferum (PTTJ033)

2.2 葡萄炭疽病病原菌分子生物学鉴定

采用ITS通用引物ITS1/ITS4对PTTJ033菌株DNA进行PCR扩增，得到长度为565 bp的DNA序列。将其在NCBI数据库进行BLAST比对，发现其与葡萄炭疽菌（C.viniferum）同源性最高，采用C.karsti为外群，基于邻近法（NJ）对PTTJ033使用MEGA 11.0构建ITS序列系统发育树（图4），发现其与C.viniferum聚在一枝。

图4 基于rDNA-ITS序列采用邻近法构建代表菌株及其相似菌株的系统发育树Figure 4 The Neighbor-Joining polygenetic tree constructed by rDNA-ITS sequence

2.3 6种杀菌剂对葡萄炭疽病菌的毒力比较

试验结果得出，6种供试药剂对菌株均有一定的抑制作用，但敏感性存在差异。从药剂的EC50值来看，三唑类药剂戊唑醇、苯醚甲环唑的抑制作用最强，EC50值分别为0.1693、0.2780 mg·L-1；其次是咪鲜胺和吡唑醚菌酯的EC50值分别为0.7461、1.4123 mg·L-1；而二氰蒽醌和代森锰锌的敏感性相对较低，EC50值分别为6.1558、21.3142 mg·L-1（表1）。

表1 6种杀菌剂对葡萄炭疽病菌菌丝生长的室内毒力Table 1 Indoor toxicity of six fungicides to Colletotrichum viniferum

2.4 6种杀菌剂对葡萄炭疽病的田间防效

进一步验证6种杀菌剂对葡萄炭疽病的田间防治效果。由表2可以看出，在试验浓度下，6种杀菌剂对葡萄炭疽病均表现出一定的田间防效，但药剂之间存在差异。430 g·L-1戊唑醇悬浮剂3000倍和10%苯醚甲环唑水分散粒剂600倍对葡萄炭疽病的防效位列前二，防效分别为81.16%和83.76%，显著优于其他4种杀菌剂；450 g·L-1咪鲜胺水乳剂1500倍和25%吡唑醚菌酯1500倍悬浮剂防效分别为77.38%和78.02%，显著优于22.7%二氰蒽醌悬浮剂800倍（73.55%）和80%代森锰锌可湿性粉剂600倍（71.25%）。22.7%二氰蒽醌悬浮剂800倍和80%代森锰锌可湿性粉剂600倍的防效显著低于其他4种杀菌剂。

3 讨论与结论

葡萄炭疽病是对葡萄危害较大的病害之一，严重影响了葡萄的产量和品质。本研究采集的PTTJ033菌种，根据形态学及与rDNA-ITS序列分析相结合，确定了引起宁阳县地区葡萄炭疽病的优势病原菌为C.viniferum，属于半知菌亚门腔孢纲黑盘孢科刺盘孢属的真菌。2011年，秦瑞凤[5]从陕西11个生产区的葡萄上首次分离到该菌种，Yan等[8]对北京、河北、河南和山东的多个葡萄炭疽病病原菌进行分离鉴定，发现了C.viniferum为葡萄炭疽病菌的致病菌，但菌种分离占比较低。近几年来，C.viniferum在北京、广西南宁、江苏句容等多个地区的葡萄炭疽病上被发现，菌种之间致病性差异较大，且强致病性菌株占比较大[9-11]。2022年，郝雨[13]选择了致病力强、产孢量大的C.viniferumcv YL2a进行葡萄与炭疽菌互作研究，并筛选出了较强的抗病资源。本研究中采集到的PTTJ033也具有较强的致病性，且分离比例较高，是宁阳地区葡萄炭疽病的主要致病菌，与以往报道的山东葡萄炭疽病主要致病菌种为C.gloeosporioides不同[14-15]。

为筛选防治该病菌的有效药剂，课题组选择6种杀菌剂对该病原菌进行了室内敏感性测定和大田药剂防治试验，发现大部分药剂对该病原菌有效，其中三唑类杀菌剂的防效显著优于其他药剂。孙行杰等[14]通过孢子萌发和菌丝生长抑制法试验得出，戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑等药剂对葡萄炭疽病菌C.gloeosporioides有较好的抑制作用。宗宇等[16]对C.gloeosporioides采用菌丝生长速率法测定了6种杀菌剂的室内防效，发现肟菌·戊唑醇抑制效果最好，苯醚甲环唑次之，嘧菌酯抑制效果最差。本试验结果与现有研究结果类似，也说明炭疽菌菌种之间防治药剂可以通用。但是，陈雷丽[17]指出，三唑类杀菌剂对炭疽菌易产生抗药性，且与丙环唑和咪鲜胺存在正交互抗性，生产中一定要注意使用频率。相较于本文研究结果，吡唑醚菌酯、二氢蒽醌、代森锰锌均可配合三唑类药剂轮流使用，以延缓抗药性的产生。

本文对宁阳县蒋集镇彩山百果园发病的葡萄炭疽病果实进行分离、纯化，得到炭疽菌属葡萄炭疽菌（C.viniferum），并确定为主要优势菌种。对生产上常用的6种杀菌剂进行室内药剂筛选和田间防治试验表明，三唑类药剂的杀菌效果显著优于其他药剂，但为了防止抗药性的产生，其他药剂也可配合轮流使用。相较于单剂的大田试验，下一步可以对复合杀菌剂的大田效果进行验证，避免单一药剂的过量使用，延缓抗药性的产生，为生产提供更多选择。