有机小分子过氧化氢荧光探针研究进展及发展方向与应用前景

张燕军，李洁丽 综述 张 凯 审校

西南医科大学：1.基础医学院 化学教研室；2.药学院(泸州 646000)

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一类高活性的含氧物质，在细胞的增殖、生长、免疫、信号传递等过程发挥着重要的作用[1]。过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）是人体内ROS 的重要组成部分，它主要来源于细胞线粒体，经线粒体传递链（electron transport chain，ETC）复合体等途径产生[2-3]。H2O2对细胞具有双重的生理作用：适量的H2O2有利于细胞的生长、分化和维持[4-5]；而过量的H2O2会引起细胞的损伤、凋亡和自噬，从而诱发炎症、心脑血管疾病、老年痴呆（senile dementia，SD）和癌症等多种疾病[6-8]。因此，精确识别和检测细胞内H2O2对生命科学研究和临床诊断都具有非常重要的意义。

针对H2O2常见的检测方法主要有：比色法[9]、电化学法[10]、质谱分析法[11]和荧光分析法[12]等。其中，基于小分子荧光探针的荧光分析法由于具有操作简单、生物相容度高、灵敏度高、选择性强、可实时原位检测等特点而备受关注；将荧光分析法与激光共聚焦显微镜技术结合而产生的荧光成像技术，也成为生物分析、检测的重要手段，应用于生物学研究、疾病早期诊断和临床治疗评价等领域[13-14]。近年来针对H2O2荧光检测和成像的研究已成为有机小分子探针发展的重要方向，本文将从小分子荧光探针的响应机理进行归纳总结，介绍H2O2荧光探针的设计、构建及生物应用，并展望其发展方向和应用前景。

1 H2O2荧光探针类型

H2O2荧光探针主要包括纳米荧光探针及有机小分子荧光探针。小分子荧光探针由于具有纯化简便、结构明确、便于调控等优点，是荧光探针发展的重要方向。通常，小分子H2O2荧光探针依靠探针分子的识别位点与H2O2反应，发生结构变化，放出相应的荧光信号，从而实现对H2O2的荧光检测。荧光探针对H2O2的响应大多是通过氧化反应实现的，主要反应类型有：硼酸酯的氧化、氧鎓离子的氧化、α-二羰基化合物的氧化、Payne/Dakin串联反应和芳基磺酸酯的过氧水解等。

1.1 硼酸酯氧化型H2O2荧光探针

在温和的条件下，硼酸酯可以与H2O2发生反应。基于这一特性，有大量的H2O2荧光探针被设计合成出来并应用于体内/外H2O2的荧光检测与成像。LIN 小组[15]以咔唑为基本荧光母核，合成了具有长波长发射性能的咔唑乙烯基吡啶盐，并以硼酸酯作为识别基团，构建了H2O2荧光探针CAI（图1）。相较于咔唑，CAI具有更长的发生波长（575 nm），更长的Stocks 位移（157 nm），可有效避免荧光自吸收现象，提高探针的灵敏度。CAI 在H2O2的作用下，硼酸酯水解，释放出酚羟基，导致荧光信号发生变化；由于吡啶盐带有正电荷，结合线粒体的质子泵作用，该探针分子还能靶向进入到细胞线粒体内[16]，实现细胞线粒体内H2O2的荧光检测。但是由于该探针属于关型，很容易受到背景干扰，这就限制了CAI在H2O2检测方面的应用。

图1 H2O2荧光探针CAI的结构和响应机理Figure 1 The structure of CAI and its response mechanism to H2O2

由于4-（二氰基亚甲基）-2-甲基-6-（4-二甲基氨基苯乙烯）-4H-吡喃（[2-[2-[4-（Dimethylamino）phenyl]ethenyl] -6-methyl-4H-pyran-4-ylidene]propanedinitrile，DCM）类染料发射波长长、光稳定性好，被广泛应用于荧光探针的设计和构建中[17-21]。GAO等[22]以近红外荧光染料DCM作为荧光母体，苄基作为可自脱落连接臂，硼酸酯作为识别基团构建了基于分子内电荷转移（intramolecular charge transfer，ICT）增强的近红外荧光探针DCM-HNU（图2），用于H2O2的荧光检测和成像。DCM-HNU 的发射在近红外区域（658 nm），可有效降低光生物荧光和光散射带来的背景干扰，且具有光毒性小、穿透性好的特点；Stocks 位移达205 nm，进一步避免了荧光自吸收现象，更有利于生物荧光检测。进一步的溶液实验证明，在pH=7.4 的缓冲体系中，DCM-HNU 对H2O2的响应具有非常好的选择性和稳定性；在0～200 μM 浓度的缓冲溶液（pH=7.4）中，DCM-HNU 对H2O2的响应表现出优良线性关系，检测限达到了0.17 μM。在此基础上，研究者将DCM-HNU应用于Hela 细胞及斑马鱼体内H2O2的荧光检测和成像，结果表明，DCM-HNU对内源性和外源性的H2O2都具有非常好的响应。

图2 近红外荧光探针DCM-HNU的结构和响应机理Figure 2 The structure of DCM-HNU and its response mechanism to H2O2

由于双光子荧光成像具有激发波长长、穿透性好、生物毒性小、空间分辨率高、可实时暗场成像等优点，已成为生物荧光成像的重要研究领域[23-25]。LI 等[26]以DCM 作为荧光单元，硼酯作为识别基团，构建针对H2O2的近红外荧光探针TPNR-H2O2（图3），进行生物体内H2O2的双光子荧光成像。通过双光子激发、TPNR-H2O2与H2O2反应后，可在近红外激发（860 nm）、近红外发射（573～ 630 nm），有效避免了生物荧光干扰。溶液中的荧光检测表明，TPNR-H2O2对H2O2的检测限达72.48 nm，可以用来检测低浓度的H2O2。MTT 实验证实探针具有较低的生物毒性后，作者将TPNR-H2O2与细胞内源性H2O2的双光子荧光成像，并通过长时间激光激发的方式考察探针的光稳定性，TPNR-H2O2在实验中表现出非常好的光稳定性，可用于细胞内H2O2的长时间动态监测。

图3 近红外荧光探针TPNR-H2O2的结构和响应机理Figure 3 The structure of TPNR-H2O2 and its response mechanism to H2O2

由于H2O2在肿瘤的产生和发展过程起着非常重要的作用，因此，发展具有肿瘤组织靶向能力的荧光探针鉴别肿瘤组织，对癌症的早期诊断具有重大意义[27-28]。ZHU 小组[29]以萘酰亚胺作为荧光基团，硼酸作为识别基团，褪黑素作为肿瘤靶向基团构建H2O2荧光探针NH-MT（图4）。实验证明，NH-MT 具有较好的水溶性，在pH=7.4的缓冲溶液中可与H2O2发生反应，进而在550 nm释放出强的荧光信号。作者进行了MTT（3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide）实验，证实探针具有较低的生物毒性；进一步的生物荧光成像实验表明，NH-MT不仅可以实现细胞及斑马鱼体内H2O2的荧光成像，还能有效识别肿瘤细胞和正常细胞，为肿瘤的早期诊断提供成像依据。

图4 H2O2荧光探针NH-MT的结构和响应机理Figure 4 The structure of NH-MT and its response mechanism to H2O2

LI 课题组[30]设计构建了喹啉盐-氧杂蒽型的近红外荧光染料QX-OH（图5），该染料的发射波长达772 nm。又以QX-OH 为荧光基团，构建荧光探针QX-B。在生理条件下，随着H2O2的加入，QX-B 被H2O2氧化，脱去硼酯和亚甲基酚，形成酚的结构，使ICT 增强，进而引起光信号的变化：溶液在585 nm 处的吸收明显降低，又在725 nm 形成一个新的吸收峰，同时在772 nm处的发射也随之增强。H2O2滴定实验证明，在0.5～50 μM 浓度范围内，探针在772 nm 处的荧光强度与H2O2的浓度呈现良好的线性关系，检测限为0.17 μM，具有定量检测H2O2的潜力。进一步的干扰实验证明生物体系内常见的干扰离子、氨基酸和活性氧均不会与QX-B发生反应，证明QX-B 具有良好的选择性。作者还采用核磁滴定和理论计算的方法，研究证实了QX-B 对H2O2响应的ICT 增强机制。MTT 实验证明QX-B 具有较低的细胞毒性，进一步细胞成像实验表明，QX-B 可以检测内源性和外源性的H2O2，其成像荧光强度与细胞内的H2O2浓度相关。最后，QX-B 还被用于斑马鱼和糖尿病小鼠模型的荧光成像。斑马鱼实验证明，QX-B 可以对生物体内的H2O2进行荧光监测。糖尿病小鼠实验表明，小鼠体内H2O2表达水平与糖尿病的发生、发展密切相关，在糖尿病引发的氧化应激过程中，H2O2主要富集在肝脏和肾脏，且对肾脏的损伤明显，这就为进一步探究荧光探针在糖尿病早期诊断和预防中的应用提供了可能性。

图5 近红外荧光探针QX-B的响应机理和成像研究Figure 5 The structure and response mechanism of QX-B to H2O2

线粒体是细胞产生活性氧的主要场所，也是次氯酸、ATP等生物活性物质的产生场所，这些活性物质在细胞微环境下共同作用，参与线粒体的各项生理活动[31-34]。因此，开发能够同时检测线粒体内多种活性物质及微环境状态的荧光探针对研究线粒体生理功能和相关的生物化学过程具有实际意义[35-37]。TIAN课题组[38]以罗丹明和萘酰亚胺为荧光母体，构建荧光探针TFP（图6），可通过双光道荧光成像同时检测线粒体内H2O2和ATP 的表达水平。萘亚酰胺一侧为H2O2响应单元，当向探针溶液中加入H2O2时，硼酸酯发生水解，紫外吸收从410 nm 蓝移至380 nm，且吸光度急剧降低；而双光子吸收截面（λex=710 nm）则从（7±2）GM升高到（35 ± 5）GM，导致470 nm 的荧光强度显著升高，同时伴随荧光寿命的提高，反应在8 min 后达到平衡；H2O2滴定实验表明，在0.4～10 μM 范围内，470 nm的荧光强度与过氧化氢呈现良好的线性关系，检测限在（68 ± 5）nM。罗丹明一侧为ATP 响应单元，ATP 可与分子中的乙二胺单元通过氢键相互作用，打开螺环，形成开环的氧杂蒽结构，释放出荧光信号。向TFP 溶液中加入ATP 后，在562 nm 出现一组新的吸收峰，而401 nm的吸收几乎不变，证实了螺环的打开；用710 nm激发光进行双光子荧光检测，发现氧杂蒽的双光子吸收截面增加至（125±12）GM，是螺环结构的50 倍，同时在590 nm出现一组强的荧光信号，并在2 min后达到平衡；滴定荧光实验表明，ATP 与TFP 的结合常数为（173±8）M-1，TFP对ATP（0.5～15 mM）的响应呈现良好的线性关系，检测限（33±2）μM；继续向溶液中加入三磷酸腺苷双磷酸酶，随着溶液中ATP的消耗，590 nm的荧光消失，证明探针对ATP的检测具有可逆性，这对实时生物检测具有非常重要的意义。进一步通过溶液实验证明了，TFP可同时选择性地检测H2O2和ATP，且没有任何能量共振转移（frster resonance energy transfer，FRET）和信号干扰的现象。最后，作者通过双光子荧光寿命成像的方法，对神经元细胞线粒体内的氧化应激过程进行研究，探讨了荧光探针在生化研究中应用的可行性。

同时实现对疾病的诊断和治疗，也是当前荧光探针研究的热点领域[39-42]。研究表明II 型糖尿病与肝肾疾病密切相关，相互促进，严重影响患者的身体健康，细胞内活性氧在中间起到了重要的作用[43-44]。YU等[45]以近红外荧光基团DX作为诊断基团，硼酯作为响应、给药基团，结合钠-葡萄糖协同转运蛋白2（sodiumdependent glucose transporters 2，SGLT-2）抑制剂达格列净设计构建了诊疗型荧光探针DX-B-DA（图7），用于II 型糖尿病及其引发的肝、肾损伤的诊断和治疗。DX-B-DA 与H2O2反应后，中间的硼酯部分脱落，同时释放出荧光基团和药物分子。溶液实验表明，向DXB-DA 溶液加入H2O2后，溶液的最大吸收波长由590 nm红移至685 nm，700 nm处的荧光也随之增强。在荧光滴定实验中，DX-B-DA 对H2O2的检测响应下限为0.36 μM，并且对细胞内的其他活性氧、氨基酸、金属离子均无明显响应，表现出良好的选择性。所以作者认为DX-B-DA 具有检测生物体内H2O2的潜力。为了验证DX-B-DA的诊疗能力，他们又以II型糖尿病小鼠模型进行进一步的生物治疗、成像实验。结果显示，诊疗分子在检测H2O2的同时，还能释放出药物分子，减轻糖尿病引发的肝肾损伤。

图6 荧光探针TFP的结构及响应机理Figure 6 The structure of TFP and its response mechanism to H2O2

图7 诊疗型荧光探针DX-B-DA的响应释放机理Figure 7 The structure of DX-B-DA and its response mechanism to H2O2

1.2 氧鎓离子氧化型H2O2荧光探针

一般开关型的荧光探针，只有一个发射波长；比率型荧光探针在同一激发波长下可发出两组不同波长的发射光，互为参照，可以根据两组发射光的强度之比实现对目标物质的准确检测[46-48]。LI 课题组[49]合成了一个具有氧鎓离子结构的比率型荧光探针GPC（图8）。由于具有较长的共轭体系和推拉电子结构，GPC 本身在410 nm 和650 nm 有两组较强的吸收；与H2O2反应后，由于共轭结构变短，410 nm 的吸收增强，650 nm 的吸收减弱，该变化通过肉眼也可以观察到。同时在以410 nm 激光作为激发光源进行的溶液荧光实验中，482 nm的荧光增强，706 nm荧光减弱。根据H2O2滴定实验，706 nm 与482 nm 处的荧光强度之比（F482/F706）与溶液中过氧化氢的浓度（1～50 μM）呈现良好的线性关系（R2=0.9981），检测限为0.33 μM。因为GPC对细胞内的其他活性物质几乎没有响应，所以具有对细胞内H2O2进行比率型荧光检测的潜力。在生物成像实验中，作者考察了探针的靶向能力，实验证明，由于糖苷的引入，GPC可以选择性地富集到肝细胞内，表现出非常强的荧光信号，而其他细胞则没有这种现象；在使用Mito-Tracker Green 进行细胞器共定位的实验中，由于氧鎓离子自身带正电，GPC更多的富集到线粒体内，Pearson系数达0.91。最后作者还将GPC用于斑马鱼模型，为药物的肝毒性研究提供成像依据。

图8 比率型H2O2荧光探针GPC的响应机理Figure 8 The structure of GPC and its response mechanism to H2O2

1.3 α-二羰基化合物氧化型H2O2荧光探针

HE 等[50]以DCM 为染料，α-二羰基化合物为识别基团构建由关到开型的近红外H2O2荧光探针DCHP（图9）。DCHP 与H2O2反应后，酰胺碱断裂，识别基团以对硝基苯甲酸的形式脱落，同时暴露出氨基，使分子的光学信号发生改变：溶液颜色由黄色变为红色；紫外吸收峰从448 nm 红移至487 nm；653 nm 的荧光信号（λex=487 nm）也增强22 倍。探针对H2O2具有良好的选择性，检测限为5.3 μM。作者在细胞水平验证探针的实用性后，还以铜离子诱发验证的斑马鱼作为模型，考察了探针对活体内H2O2的成像能力。

图9 近红外H2O2荧光探针DCHP的响应机理Figure 9 The structure of DCHP and its response mechanism to H2O2

1.4 Payne/Dakin串联反应型H2O2荧光探针

YE等[51]以对亚甲基邻羟基苯甲醛作为识别基团，萘亚酰胺和试卤灵作为荧光信号基团，分别设计构建了基于Payne/Dakin 串联反应的比率型荧光探针HKPerox-Ratio 和近红外荧光探针HKPerox-Red（图10），对H2O2具有很好的选择性。HKPerox-Red被用来研究斑马鱼活体内的氧化应激现象，对H2O2表现出良好的响应性能，又被用来检测含有葡萄糖、尿酸和肌氨酸等与糖尿病、痛风、前列腺癌相关物质的生物样本。HKPerox-Ratio被用于白血病细胞内H2O2的荧光检测，首次通过流式细胞仪和活细胞校正曲线实现了活细胞内源性H2O2的准确定量分析。作者期望探针可用于H2O2生理、生化作用方面的研究，并为药物筛选和疾病诊断提供依据。

1.5 磺酸酯型H2O2荧光探针

图10 H2O2荧光探针HKPerox-Ratio和HKPerox-Red的响应机理Figure 10 The response mechanism of HKPerox-Ratio and HKPerox-Red to H2O2

GUO等[52]开发了一种基于磺酸酯水解反应的近红外荧光探针Cy-PFS（图11）。苯并花菁作为荧光基团，具有近红外发射、生物相容度高、生物毒性低、吸光系数大等特点[53-54]；因为响应机制为五氟甲磺酸的H2O2水解反应，可以有效避免生物环境中其他活性氧化物的干扰，提高探针的选择性；苯环上的五个氟原子可以增强磺酸酯的H2O2水解活性，促进探针的灵敏度。由于推拉电子的长共轭结构，Cy-PFS 的最大吸收峰达830 nm，加入H2O2后，长共轭结构被酮式结构Keto-CY取代，在560 nm 出现一个新的吸收峰；在730 nm 光源激发下，Cy-PFS的发射峰位于836 nm，加入H2O2后，使用560 nm光源激发，635 nm处的发射随之增强；因此，可以通过635 nm和836 nm两处不同的发射波长，构建比率型荧光探针，对H2O2进行近红外荧光成像。H2O2滴定实验表明，0～100 μM 内，lg（F635/F836）与H2O2的浓度呈线性关系（R2=0.9880），检测限50 nM。根据化学动力学实验，10 μM 的Cy-PFS 与100 μM 的H2O2可在200 s内完成反应，反应的准一级速率常数为6.9×10-3S-1。外加其他活性氧化物、氨基酸、金属离子等，对检测不产生干扰，证明探针具有非常好的选择性。在此基础上，使用激光共聚焦荧光成像，可以对细胞内H2O2进行监测，进而研究与之相关的能量代谢和细胞增殖过程。最后，Cy-PFS被用来检测不同发育阶段小鼠大脑内H2O2的表达水平，研究了内源性H2O2与小鼠大脑发育及细胞有丝分裂密切相关，首次阐明了内源性H2O2可以作为信号分子促进细胞的有丝分裂，加速大脑的发育。

图11 比率型荧光探针Cys-PFS的结构及响应机制Figure 11 The structure of Cys-PFS and its response mechanism to H2O2

2 小结与展望

荧光检测技术是当前针对生物活性物质的重要研究手段，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、可实时原位分析等优点。荧光成像技术将荧光探针与激光共聚焦显微镜技术结合，可对细胞、组织和活体内的活性物质进行实时原位成像分析，是当前生命科学、医学和化学领域研究的前沿科学技术。

本文主要综述了近五年H2O2荧光探针的研究进展，在响应机理的基础上，归纳总结了部分H2O2荧光探针的设计策略、发展方向及其在生物学研究中的应用，表明荧光探针在生物以及临床诊断、治疗领域中发挥着极其重要的作用。但是，当前报道的H2O2荧光探针发射波长大多集中在可见光及近红外一区，导致其组织穿透性和空间分辨率不足，限制了荧光探针在生物活体成像领域的应用。由于近红外二区的荧光探针激发波长更长、穿透性更强、光毒性更小、背景干扰更低等特点，开发新型近红外二区荧光染料，并将其作为荧光基团构建近红外二区的荧光探针是今后H2O2荧光探针发展的重要方向。此外，因为单一荧光成像仍然很难满足目前对深层、活体、超灵敏、三维、高时空分辨率等检测的需求，因此，结合核磁、光声等成像手段构建针对活体内H2O2检测的多模态生物检测平台，也是未来荧光探针发展的重要内容。