女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致大鼠肾毒性的保护作用

夏文彬，石阿茜，沈阗阗，陈 晨，魏玉辉

兰州大学第一医院药剂科(兰州 730000)

中医临床用药的主要形式为中药配伍，即两种或两种以上的药物相互配合使用从而发挥协同增效的作用。在中药配伍理论中，药对（根据配伍规律在临床上多年使用的相对固定的两味中药）是中药配伍的基本单位，亦是中药方剂的重要组成部分和基础[1]，经配伍后的方剂往往可以增强疗效，降低毒性[2]。中药女贞子和淫羊藿配伍组成的药对是由国家级老中医李世增教授根据50余年的临床经验精选而出，具有平衡肾中阴阳两虚的功效[3]。国内学者对女贞子-淫羊藿药对的研究主要集中在老年性骨质疏松症、哮喘等方面[4-6]。作为经典的滋补肾阴阳配伍使用的女贞子-淫羊藿，是否对药物性肾损伤有保护作用鲜有报道。本研究旨在研究女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致大鼠肾毒性的保护作用，并从抗氧化和抗炎两方面对其发挥肾保护作用的分子机制进行探讨，为女贞子-淫羊藿药对的临床合理应用提供新的循证依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

女贞子和淫羊藿均购于甘肃冠兰中药饮片有限公司，经甘肃省药品检验研究院宋平顺教授鉴定为木犀科植物女贞（Ligustrum lucidumAit）的干燥成熟果实和小檗科植物淫羊藿（Epimedium brevicomuMaxi）的干燥叶。顺铂（P4394）购自Sigma 公司；Anti-NADPH oxidase 4（NOX4）抗体（1∶1 000；ab133303）购自abcam；大鼠肾损伤分子1（KIM-1）抗体（1∶1 000；AF3689）购自R&D SYSTEMS；NADP+/NADPH试剂盒（S0179）购自上海碧云天生物技术有限公司；还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）和白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）等ELISA 试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

PD-1C-50冷冻干燥机（上海比朗仪器制造有限公司）；Multiskan FC型酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司）；DYCZ-24DN电泳仪（北京六一仪器厂）；DYCZ-40N湿转仪（北京六一仪器厂）；WD-9405B水平脱色摇床（北京六一仪器厂）。

1.2 实验动物

SPF 级Wistar 雄性大鼠（180～ 200）g 30 只购自中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，合格证号为SCXK（甘）2015-0001。动物于温度（24 ± 1）℃、湿度50%～70%、12 h明暗交替的条件下适应性饲养1周，自由进食饮水，定期更换消毒垫料。所有动物实验操作均符合动物实验原则并获得兰州大学第一医院医学伦理委员会批准（编号：LDYYLL2020-29）。

1.3 女贞子-淫羊藿水提物粉末的制备

分别称取3 份女贞子100 g 和淫羊藿50 g（根据兰州大学第一医院院内制剂仙贞扶正颗粒中君药女贞子-淫羊藿配伍比例2∶1 作为参考），混合后加入15 倍量的蒸馏水浸泡1 h，强火煮沸后文火保持微沸煎煮1 h，过滤收集上清药液，加热浓缩至150 mL 左右，为满足冷冻干燥机抽真空制备成粉末的条件，浓缩液放-20℃冷冻过夜形成固体即可，最后置于冷冻干燥机（-50 ℃，<10 Pa）得女贞子-淫羊藿水提物的冷冻干燥粉（17.36±4.68）g，提取率为（11.68±2.34）%。

1.4 动物分组及给药

将30只Wistar大鼠（180～200）g，应用随机数字表法，分为对照组（Control 组）、模型组（Model 组）、女贞子-淫羊藿药对组（YD组），每组10只。对照组每日灌胃蒸馏水25 mg/kg，连续7 d；除对照组外，其他两组均于第4 d腹腔注射顺铂3 mg/kg[7-8]；女贞子-淫羊藿药对组每日灌胃350 mg/kg水提物，连续给药7 d。

1.5 大鼠体重变化率和肾脏指数的计算[8]

1.6 大鼠血清生化指标及肾脏组织病理学考察

末次给药禁食12 h 后，腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 500 rpm离心10 min后分离出血清，-80 ℃保存。全自动生化分析仪测定血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CREA）和尿酸（Uric acid，UA）。颈部异位处死大鼠，摘取肾组织，用生理盐水清洗并用滤纸擦干，置于10%甲醛溶液中固定48～72 h，苏木素-伊红染色（hematoxylineosin staining，HE），光学显微镜下观察肾组织病理学变化。

1.7 肾组织中KIM-1和NOX4表达水平检测

将脱蜡的肾组织切片与KIM-1（1∶20）和NOX4（1∶200）的一抗在4 ℃下孵育过夜，用PBS 洗涤三次后，将样品与二抗在37 ℃孵育1 h，用PBS 洗涤三次，然后用3，3’-二氨基联苯胺（DAB）染色，用苏木精复染，通过光学显微镜观察免疫染色强度。

肾组织0.04 g于1.5 mL离心管中，加入含PMSF的RIPA 裂解液400 μL 充分匀浆，液氮反复冻融3 次后，4 ℃条件下14 000 rpm低温离心10 min，收集上清液加入5×蛋白上样缓冲液（样品上清∶上样缓冲液=4∶1），95 ℃加热变性5 min。梳孔中依次加入Marker 和样品蛋白，先调节电压为75 V，待溴酚蓝电泳到达分离胶时调整电压为120 V至电泳结束。分离蛋白质后，在50 V恒压下转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上200 min，用5%脱脂牛奶全封闭1 h（以破坏非特异性结合）后，将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。用TBST 洗涤三次后，将膜与二抗在室温下孵育1 h，使用ECL化学发光检测信号，并用Image J软件测量蛋白质条带强度。

1.8 肾组织中MDA、SOD、CAT、GSH 和NADP+/NADPH的测定

按照南京建成生物工程研究所提供的商业化试剂盒说明书，检测波长在405、420、450和532 nm下CAT、GSH、SOD和MDA的OD值，通过BCA法得到的50个样品组织浓度，并利用相关公式计算上述指标的含量水平。此外NADP+/NADPH 水平按照上海碧云天生物技术有限公司提供的试剂盒说明书进行检测。

1.9 肾组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的测定

按照上海酶联生物科技有限公司提供的ELISA试剂盒说明书，检测450 nm IL-1β、IL-6 和TNF-α 的OD值，通过BCA 法得到的50 个样品组织浓度，并利用相关公式计算上述指标的含量水平。

1.10 统计学方法

用SPSS 25.0软件对数据进行统计学分析，结果以均数±标准差（）描述，多组间比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），LSD 法进行多重比较，P <0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠体重和脏器指数的影响

大鼠腹腔注射顺铂后，摄水量和摄食量明显减少，女贞子-淫羊藿药对治疗前后体重及脏器指数变化情况如表1所示：与对照组相比，模型组大鼠体重显著降低（P<0.05），肾脏器指数明显升高（P<0.001）；给予女贞子-淫羊藿药对水提物后，肾脏器指数显著下降（P<0.05），但大鼠体重并无明显变化，见表1。

2.2 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠血清生化指标和组织病理学的影响

女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠血清生化指标的影响如表2所示：与对照组相比，模型组大鼠血清BUN 和CREA 显著升高（P<0.05），UA 也有一定程度的升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，女贞子-淫羊藿药对组血清BUN和UA显著性降低（P<0.05），CREA也有一定程度降低，但差异无统计学意义（P>0.05）对顺铂所致肾毒性大鼠组织病理学的影响，见图1。

表1 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠体重和脏器指数的影响（，n=10）Table 1 Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on body weight and renal index of cisplatin induced nephrotoxicity in rats（，n=10）

表1 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠体重和脏器指数的影响（，n=10）Table 1 Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on body weight and renal index of cisplatin induced nephrotoxicity in rats（，n=10）

注：YD表示女贞子-淫羊藿药对组；a与对照组相比，P<0.05；b与对照组相比，P<0.001；c与模型组相比，P<0.05。

表2 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠血清生化指标的影响（，n=10）Table 2 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on serum biochemical indicators in rats with cisplatin induced nephrotoxicity（，n=10）

表2 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠血清生化指标的影响（，n=10）Table 2 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on serum biochemical indicators in rats with cisplatin induced nephrotoxicity（，n=10）

注：YD表示女贞子-淫羊藿药对组；a与对照组相比，P<0.05；b与对照组相比，P<0.01；c与模型组相比，P<0.05；d与模型组相比，P<0.01。

图1 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠组织病理学的影响（放大倍数=200×，比例尺=50µm）Figure1 Effects of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on histopathological change in the kidney（Magnification=200×，Scale bar=50µm）

2.3 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠KIM-1的影响

肾组织中近端肾小管特异性生物标志物KIM-1的蛋白表达水平如图2A 所示：与对照组相比，模型组KIM-1蛋白表达显著性增加（P<0.05）；给予药对水提物后，可显著下调顺铂引起肾脏KIM-1 蛋白的表达（P<0.05）。免疫组化表达情况如图2B 所示：与对照组相比，模型组大鼠肾小管细胞膜、胞浆肾皮质和肾髓质交界处的管腔中可见大量KIM-1阳性抗原，且KIM-1 蛋白表达明显增多；给予药对水提物后，肾组织中KIM-1阳性表达的肾小管数量明显减少，见图2。

图2 女贞子-淫羊藿药对对顺铂致肾毒性大鼠KIM-1的影响（放大倍数=200×，比例尺=100µm，，n=10）Figure 2 Effects of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on KIM-1 in rats with nephrotoxicity induced by cisplatin（magnification=200×，Scale bar=100µm，，n=10）

2.4 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠抗氧化酶NOX4和氧化应激标志物的影响

氧化应激在顺铂肾毒性中起关键性作用，因此通过检测相关抗氧化酶NOX4和氧化应激标志物（MDA、SOD、CAT 和GSH）来评估氧化损伤程度。因氧化应激可以提高活性氧ROS 的水平[9]，且ROS 主要来源NADPH 氧化酶，故利用试剂盒检测大鼠肾脏NADP+/NADPH 比值结果如表3 所示，与对照组相比，模型组NADP+/NADPH比值升高，给予药对水提物后，NADP+/NADPH 比值显著性降低（P<0.05）。NOX4 蛋白表达及免疫组化实验结果如图3A、B 所示：与对照组相比，模型组肾脏组织中NOX4阳性信号表达加强且蛋白表达升高；给予药对水提物后，NOX4阳性信号减弱，蛋白表达也有所降低，但无显著性差异，见表3、图3。

表3 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠肾脏NADP+/NADPH比值的影响（，n=10）Table 3 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on NADP+/NADPH ratio in rats with cisplatin induced nephrotoxicity（，n=10）

表3 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠肾脏NADP+/NADPH比值的影响（，n=10）Table 3 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on NADP+/NADPH ratio in rats with cisplatin induced nephrotoxicity（，n=10）

注：YD表示女贞子-淫羊藿药对组；a与对照组相比，P<0.001；b与模型组相比，P<0.001。

图3 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒大鼠肾组织中NOX4的影响（放大倍数=200×，比例尺=100µm，，n=10）Figure 3 Effects of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on NOX4 in renal tissues of rats with cisplatin induced nephrotoxicity（magnification=200×，Scale bar=100µm，，n=10）

考察氧化应激标志物MDA、CAT、SOD和GSH水平如表4所示：与对照组相比，模型组肾脏中脂质过氧化物MDA 蓄积显著升高（P<0.05），抗氧化酶CAT、SOD和GSH 活性均显著性降低（P<0.05）；女贞子-淫羊藿药对干预后，大鼠肾脏MDA累积明显降低（P<0.05），CAT、SOD 和GSH 抗氧化能力显著性提高（P<0.05），见表4。

表4 女贞子-淫羊藿药对对大鼠肾脏氧化应激标志物的影响（，n=10）Table 4 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on oxidative stress markers in rat kidney（，n=10）

表4 女贞子-淫羊藿药对对大鼠肾脏氧化应激标志物的影响（，n=10）Table 4 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on oxidative stress markers in rat kidney（，n=10）

注：YD表示女贞子-淫羊藿药对组；a与对照组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05；c与模型组相比，P<0.01。

2.5 女贞子-淫羊藿药对对顺铂所致肾毒性大鼠炎症因子的影响

用ELISA法检测肾组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β 水平，结果如表5 所示：与对照组相比，模型组大鼠肾组织匀浆中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，给予药对水提物后可显著降低肾组织匀浆中TNF-α 和IL-6 的水平（P<0.05），IL-1β 水平有所降低，但无显著性差异（P>0.05），见表5。

3 讨论

顺铂是临床上应用最广泛治疗多种实体瘤的化疗药之一，可用于睾丸癌、肺癌、宫颈癌和卵巢癌等各种类型的癌症[10]，然而它的临床应用受到其严重的剂量依赖性毒副作用限制，其中最常见的是肾毒性[11]。近年来，越来越多的肿瘤患者在肿瘤细胞侵袭和治疗手段毒副作用的双重损伤下，更愿选择中医药作为疾病的辅助治疗，不仅可以改善人体脏腑功能，还可使机体恢复正常水平。除此之外，众多国内外学者致力于探讨传统中药防治顺铂肾毒性的研究[12-13]，其中中药提取物、中药单体的报道日益增多[14-16]，女贞子与淫羊藿配伍的药对具有补肾壮骨之功效[17]，但其对顺铂所致肾毒性是否发挥肾保护作用缺乏研究。故本研究重点对女贞子-淫羊藿药对对临床化疗药顺铂所致大鼠肾毒性的肾保护作用及机制进行探讨。

表5 女贞子-淫羊藿药对对大鼠肾脏炎症因子标志物的影响（，n=10）Table 5 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on inflammatory factor markers in rat kidney（，n=10）

表5 女贞子-淫羊藿药对对大鼠肾脏炎症因子标志物的影响（，n=10）Table 5 The Effect of Ligustrum lucidum and Epimedium brevicornum on inflammatory factor markers in rat kidney（，n=10）

注：YD表示女贞子-淫羊藿药对组；a与对照组相比，P<0.05；b与对照组相比，P<0.01；c与模型组相比，P<0.05。

美国食品和药物管理局FDA 和欧洲药品管理局（EMEA）批准了7 种可能影响临床决策的肾毒性检测新生物标志物：KIM-1、白蛋白、B2-微球蛋白、胱抑素C、总蛋白簇蛋白和三叶因子-3[19-20]。其中，肾损伤分子KIM-1 是一种肾近端小管顶端跨膜糖蛋白，其在健康患者尿液中浓度非常低，而在患有肾损伤的动物和人类尿液中，其浓度与肾损伤程度呈正相关，同时也表明炎症的严重程度，可能是一种能够早期识别肾损伤的潜在生物标志物，且被一些作者认为KIM-1 对顺铂肾毒性有着预测作用[21-22]。故本研究利用免疫组化和Western blotting 法检测大鼠肾组织中KIM-1 的蛋白表达水平，发现经顺铂诱导的肾毒性大鼠KIM-1 蛋白表达显著性升高，女贞子-淫羊藿药对干预后可降低KIM-1的表达，从而缓解肾损伤程度。

氧化应激在顺铂肾毒性的发病机制中起着至关重要作用[23]。当活性氧ROS的产生和抗氧化防御系统之间缺乏平衡时，氧化应激随之而来。顺铂肾毒性中产生的ROS 主要来源于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，也称为NOXs[24-25]。NOXs 家族由7种亚型组成：NOX1 表达于结肠组织，NOX2 表达于吞噬细胞，NOX3 表达于内耳，NOX5 表达于淋巴组织，Duxo1 和Duxo1 表达于甲状腺和支气管，其中NOX4 主要在肾脏中高表达[26]。因此采用免疫组化和Western blotting 考察了大鼠肾脏NOX4 表达的水平，结果显示女贞子-淫羊藿药对通过抑制NOX4 氧化酶发挥肾保护作用。与此同时，还检测了氧化应激标志物的水平，SOD 可催化超阳阴离子生成过氧化氢和氧气，MDA 是氧自由基和脂质过氧化的最终产物，均可反映机体的损害情况[27]。顺铂诱导的肾毒性会产生大量的ROS和消耗GSH，降低SOD 和CAT 的水平，并导致MDA 的蓄积[28]。在本研究中也观察到了类似的现象，且女贞子-淫羊藿药对预处理后可有效的将这些氧化应激标志物变化逆转到相对正常的水平。除此之外，炎症在顺铂所致肾毒性的发病机制中同样起着重要作用[29]。在本研究中，暴露于顺铂的大鼠肾组织中的炎症因子TNFα、IL-6和IL-1β水平显著增加，女贞子-淫羊藿药对可明显降低其在肾组织中的水平。

4 结论

本研究结果显示，女贞子-淫羊藿药对可降低顺铂诱导肾毒性小鼠BUN 和UA，明显缓解肾小管损伤，发挥肾保护作用。其机制可能与抑制肾组织中KIM-1的表达、激活抗氧化酶的活性和抑制炎症因子的释放有关。