牙龈卟啉单胞菌对消化道肿瘤作用机制研究

占云梅，黄杨文，张桂生，刘新颖，黄小明，孟 凡

（1. 赣南医学院第一临床医学院；2. 赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000）

消化道肿瘤包括口腔癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌等，严重威胁民众的生命健康。据国家癌症中心最新公布的数据显示，我国消化道肿瘤依然呈现出高发病率和死亡率的特点，在部分肿瘤类型中甚至高于世界平均水平［1］，寻找更为切实可控的防治靶点是临床科研不容忽视的重要命题。长期与人体共生的微生物，在消化道的不同菌落区域中以超过100 万亿的庞大数量寄生［2-3］，并以其性质和数量的动态变化影响着机体的健康状况。高通量基因测序（16S ribosomal RNA，16S rRNA）的发展，向人们证实了消化道微生物与特定疾病间的因果关系［3-6］。机制上来说，消化道黏膜作为机体先天性免疫的屏障之一，特定菌群的局部定植，可通过病原相关分子模式诱导肠上皮和相关免疫细胞表达包括Toll样受体（Toll-like receptors, TLR）、NOD 样受体（NOD-like receptors, NLR）等在内的模式识别受体（Pattern recognition receptors, PRR），促发一系列炎症级联信号，引发异常增殖导致肿瘤［7］。

口腔是消化道的门户，其微生物组分种类繁多、分布密集［8］。现已证实，牙龈卟啉单胞菌是严重牙周炎的病原体［9］，且与口腔以外的多种疾病关系密切［10］，近期的多项临床和动物性研究更是指向其与消化系统肿瘤之间的直接因果关联［11-12］。与此同时，GAO S G等［13］发现，牙龈卟啉单胞菌的血清抗体对早期食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）进行诊断的敏感性、特异性均优于传统的血清肿瘤标志物（SCCA、CEA、CA19-9 等）；CHEN M F等［12］也证实，牙龈卟啉单胞菌与晚期ESCC 的TNM分期和预后不良相关，在小鼠肿瘤诱导模型中该菌可促进异种移植瘤的发生和进展。鉴于牙龈卟啉单胞菌在消化道肿瘤诊断中具有重要参考价值，同时也是肿瘤相关的潜在独立风险因素，充分了解其结构功能及致病机制，或可为临床提供新的诊疗视角。基于此，本文就其主要毒力因子及相关致病机制的研究进展进行综述。

1 牙龈卟啉单胞菌主要毒力因子的构成和作用

牙龈卟啉单胞菌是革兰氏阴性厌氧菌，其主要毒力因子包含菌毛、脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）、牙龈蛋白酶、血凝素（Hemagglutinin, HA）等，可通过分泌外膜囊泡（Outer membrane vesicles, OM）的形式将LPS和牙龈蛋白酶等传递到远处作用而扩大影响范围［14］，侵袭包括上皮细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞及树突状细胞在内的宿主细胞［15］。

1.1 牙龈卟啉单胞菌菌毛促细菌黏附和诱导早期炎症菌毛是细菌外膜的延伸，可加强细菌与宿主之间的黏附。牙龈卟啉单胞菌存在2 种类型的菌毛，即长菌毛和小菌毛。编码菌毛蛋白（41 kDa）的长菌毛基因FimA有6 种变体，分别为FimAⅠ型～Ⅴ型，以及Ⅰb型，编码小菌毛蛋白（fa蛋白，67 kDa）的则为mfa1基因，虽然2 种菌毛蛋白都有助于牙龈卟啉单胞菌的黏附入侵［16］，但有研究表明，FimA缺陷菌株没有典型的菌毛［16］，菌毛的致病性只与FimA基因型关联密切，而与mfa1基因型无关［17-18］。其主要致病机制可归纳如图1 所示：长菌毛通过结合整合素蛋白α5β1 与TLR2 的相关受体-趋化因子受体4 相互作用，抑制TLR2 介导的NF-κB 促炎通路，实现牙龈卟啉单胞菌对宿主细胞的侵袭和抗清除功能［19］；通过结合受体CD14 激活TLR2 和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路，诱发补体受体3（CR3）活化，并与之进一步相互作用下调活性白细胞介素12（IL-12 p70，一种与细菌清除有关的细胞因子）［9］。此外，CAI J等［20］通过基因克隆构建质粒的方法证明了FimA 融合蛋白还可通过TLR4 信号通路诱导炎症，产生多种细胞因子和趋化因子，杀伤宿主细胞。值得注意的是，牙龈卟啉单胞菌菌毛的发生机制涉及前体亚单位蛋白的水解和重新聚合，聚合前的水解处理需要由牙龈蛋白酶参与［19］，而聚合可以被菌毛蛋白保守C端相应的肽基抑制剂阻断［21］。

1.2 牙龈卟啉单胞菌脂多糖维持自身营养并促炎症发展脂多糖（LPS）是牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡的外层组分，与细菌侵袭力密切相关，体外实验中可促进多种细胞体系的增殖和迁移［22-23］。牙龈卟啉单胞菌产生2 种LPS：常规的O-LPS 和阴离子O-LPS（A-LPS），A-LPS一方面是蛋白酶等毒力效应物质的载体［19］，另一方面可促进μ-氧基双血红素在细菌表面沉积［24］。众所周知，牙龈卟啉单胞菌是血红素依赖型细菌，需要利用外源性铁和原卟啉以维持自身的生长繁殖及存活［25］。它的主要血红素来源是血红蛋白［26］，通过A-LPS 可实现将由血红蛋白转化的μ-氧基双血红素作为营养储存下来［24］，而非酶糖化的血红蛋白则可使血红素获取更容易［26］。致病性方面，牙龈卟啉单胞菌LPS 可通过与先天免疫Toll样受体中的TLR1 和TLR4 相互作用，促进细胞因子如IL-6、IL-8 和TNF-α 的分泌，进而发挥促炎效应［27］。LIU J等［28］从氧化应激的角度，展示牙龈卟啉单胞菌的LPS 可通过诱导丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB活化，促进活性氧（Reactive oxygen species，ROS）释放介导炎症，且p53作为炎症介质发挥调节作用。此外，DIOMEDE F 等［29］用牙龈卟啉单胞菌的LPS 作用于人的牙周膜干细胞，发现干细胞中的DNA 甲基化酶DNM1 显著下降，同时组蛋白乙酰化酶p300 以及NF-κB 水平显著提升，说明牙龈卟啉单胞菌的LPS还可通过调节表观遗传相关基因实现炎症诱导。

1.3 牙龈卟啉单胞菌半胱氨酸蛋白酶水解多种宿主蛋白促肿瘤侵袭牙龈卟啉单胞菌能产生2种半胱氨酸蛋白酶（Gingipains）：精氨酸特异性牙龈蛋白酶（RgpA、RgpB）和赖氨酸特异性牙龈蛋白酶（Kgp）。其中RgpA 和Kgp 拥有相同的结构特点，即都包含催化结构域和血凝素（HA）结构域，而RgpB只有催化结构域［27］。Gingipains 参与细菌对宿主细胞的黏附，另外作为一种蛋白水解酶，还能降解包括宿主表面膜蛋白、免疫调节蛋白、黏附蛋白、信号蛋白及补体、受体、细胞因子在内的多种蛋白成分，作用非常广泛。在获取自身营养素的同时改变了免疫微环境，对宿主细胞造成损伤，是重要的毒力因子。有研究［27］表明，Gingipains能与蛋白酶活化受体（PAR）中的PAR2 或PAR4 结合，磷酸化后激活NF-κB、ERK1/2-Ets1、p38/HSP27 等通路，产生基质金属蛋白酶9（MMP9）的前体pro-MMP9、pro-MMP9在经进一步切割水解后可形成活化的MMP9，并通过正反馈活化pro-MMP9，形成循环放大效应。MMP9 因可降解宿主细胞基底膜及胞外基质，通常认为与侵袭、转移密切相关。此外，Gingipains 水解过程还可通过非经典途径激活β-连环蛋白，这被认为是牙龈卟啉单胞菌促瘤的另一种潜在机制［30］。

1.4 牙龈卟啉单胞菌血凝素协同Gingipains 获取自身生长营养素牙龈卟啉单胞菌通过获取外源性血红素满足自身营养需求，这个过程是由Gingipains和血凝素共同完成的［31］。具体表现为，血凝素与宿主红细胞表面受体结合，Rgp 将氧合血红蛋白转化为高铁血红蛋白，后者进一步被Kgp水解，释放出血红素，并最终以μ-氧基双血红素的形式保留在细胞表面［24］。通过这种协同分工，牙龈卟啉单胞菌实现对营养素的获取。

1.5 牙龈卟啉单胞菌肽基精氨酸脱氨酶瓜氨酸化蛋白质扩大炎症程度和范围牙龈卟啉单胞菌还能产生肽基精氨酸脱氨酶（Peptidylarginine deiminases, PAD），这是目前能产生这种酶的唯一病原体。通过去除蛋白质和多肽中的精氨酸残基，使之转化成瓜氨酸，在改变原有空间构象的基础上，对宿主和自身蛋白质进行修饰，并最终解除宿主炎症信号的控制。宿主体内有5种钙依赖性PAD可实现这种瓜氨酸化，分别为PAD1、2、3、4/5、6，它们通常均与癌症相关［30］。有学者认为，PAD 通过分泌的方式传播到血液中，可使身体的不同部位产生瓜氨酸，最终引发多种疾病［32］。ZHAO X D 等［33］在实验中敲除小鼠牙龈卟啉单胞菌脱氨酶（Porphyromonas gingivalis peptidylarginine deiminase, PPAD）基因，通过流式细胞术和ELISA，发现PPAD 可显著增加辅助性T 细胞Th17 细胞的数量，但减少调节性T 细胞Treg 的数量；在进一步的体外实验中他们得到了相同的结果，说明PPAD 也可对机体免疫系统产生作用。

2 牙龈卟啉单胞菌诱发消化道肿瘤产生的机制

2.1 牙龈卟啉单胞菌分泌抗凋亡磷酸激酶并调控线粒体凋亡通路抑制宿主细胞凋亡LEE J 等［34］通过构建牙龈卟啉单胞菌NDK 缺陷突变株进行功能实验，首次证明了牙龈卟啉单胞菌分泌的核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase, NDK）可磷酸化热休克蛋白HSP27，参与抑制牙龈上皮细胞（Gingival epithelial cells, GEC）的凋亡。在这之前，曾有研究［35］提示，三磷酸腺苷（ATP）与嘌呤受体P2X7 结合可使细胞凋亡，而NDK 可通过参与分解ATP 来抑制这一凋亡路径。总之，牙龈卟啉单胞菌NDK 是重要的抗凋亡蛋白。与此功能类似的是，牙龈卟啉单胞菌还调控2 条线粒体凋亡通路，分别是PI3K/Akt 和JAK/STAT 通路［36-37］。它们产生的活化蛋白激酶B（Akt）和信号转导及转录激活蛋白（STAT）可使促凋亡蛋白Bad减少，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl 的比例升高，最终发挥抗凋亡作用。此外，Bcl-2 与Akt 激发的NF-κB 通路还协同抑制半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3），后者是一种促凋亡蛋白。

2.2 牙龈卟啉单胞菌调控细胞周期并上调促炎信号通路以促进宿主细胞增殖细胞增殖是生长繁殖的前提，受细胞周期的精密调节。KUBONIWA M等［38］发现，牙龈卟啉单胞菌感染GEC 可通过调控P53、PI3K 和细胞周期蛋白等改变细胞周期。具体表现为，下调抑癌基因P53水平，下调PI3K/Akt路径负调控因子-同源性磷酸酶张力蛋白（Phosphatase and tensin homolog, PTEN）基因水平，以及上调周期蛋白A的表达水平，三者协同促进宿主细胞G1期向S期转化，并使S期进程加快。MENG F等［39］在ESCC中也证实了牙龈卟啉单胞菌可通过激活NF-κB（p65）信号路径上调细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和细胞性骨髓细胞瘤病毒癌基因（c-Myc）水平［39］。此外，在人类口腔上皮中，牙龈卟啉单胞菌还能通过上调参与免疫的多个关键基因，激活NF-κB、TLR 及MAPK通路，促进增殖［40］。

2.3 牙龈卟啉单胞菌诱导宿主上皮间充质转化促进肿瘤细胞迁移和侵袭牙龈卟啉单胞菌潜在致癌特性之一，表现为它可以促进上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT），实现肿瘤细胞侵袭和转移，这主要通过产物MMPs发挥作用。除上述提及的路径以外，有研究［41］表明，牙龈卟啉单胞菌感染GEC 后可诱导控制EMT 的关键转录因子Zeb1高表达，促进MMP-9表达增多。且牙龈卟啉单胞菌诱导EMT 的过程同时上调了Zeb1 和Zeb2［27］。值得一提的是，这是通过FimA 菌毛蛋白驱动的。非活性状态下的糖原合成酶激酶-3β（p-GSK3β）在口腔鳞状上皮细胞癌（OSCC）中发挥了重要的EMT介质作用，表现为促进EMT 相关转录因子Slug、Snail和Zeb1的转录和表达，而抑制黏附分子E-钙黏蛋白的表达［42］。此外，牙龈卟啉单胞菌还能通过Notch 信号通路中的Notch1 提高对化疗药物紫杉醇的耐药性，降低化疗效果，促进肿瘤转移［43］。

2.4 牙龈卟啉单胞菌抑制宿主免疫并调节自噬以介导肿瘤细胞逃避免疫攻击在免疫调节方面，B7-H1受体（即程序性死亡配体PD-L1）介导负性调节T 细胞活化，牙龈卟啉单胞菌可诱导口腔上皮中的B7-H1受体高表达，导致T细胞活化无能或凋亡［44］，产生免疫逃避。在OSCC 中，牙龈卟啉单胞菌还能通过诱导高表达趋化因子CXCL2、CCL2 和细胞因子IL-6、IL-8，招募髓系来源的抑制细胞（MDSC），并依托MDSC 对T 细胞活化强大的免疫抑制性，降低宿主存活率［45］。此外，牙龈卟啉单胞菌还能对骨髓来源的巨噬细胞产生抗吞噬作用，使癌变细胞免受吞噬细胞的攻击［46］；而通过对自噬小体进行修饰，可维持自身在自噬体内长久存活，避免被溶酶体降解。值得一提的是，细菌这种抗吞噬溶解的功能是通过自身蛋白分泌系统实现的。

2.5 牙龈卟啉单胞菌在转录和翻译水平调控宿主表观遗传以促进疾病进展miRNA 是靶向作用于mRNA 的一类单链RNA 小分子，参与转录后调控。牙龈卟啉单胞菌感染可对宿主细胞的多种miRNA进行差异性调节。比如通过上调miRNA-203，降低细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）表达水平，激活下游靶点转录激活子3（Stat3），诱导GEC 抗凋亡［47］；上调miRNA-21，负向调节程序性细胞死亡因子4（PDCD4）和转录激活因子1（AP1），提高Cyclin D1表达水平，促进OSCC增殖［48］；上调miRNA-194，降低粒状转录因子3（GRHL3）和PTEN 表达，提高p-Akt水平，促进ESCC 增殖和迁移等［49］。此外，牙龈卟啉单胞菌还能对宿主DNA 和组蛋白分别或同时进行修饰实现促炎、促增殖效应［50］。

3 总结与展望

消化道癌症起病隐匿，被诊断时往往已到晚期，预后不甚理想，早期发现和采取干预显得尤为重要。除了家族遗传倾向性、不良生活饮食习惯等常规致癌因素外，细菌感染塑造的异常免疫微环境对机体的影响亦不容忽视。得益于16SrRNA 基因测序技术，我们发现牙龈卟啉单胞菌与消化道癌症存在直接关联。通过对牙龈卟啉单胞菌主要毒力因子及致病机制的了解，我们看到了针对免疫微环境方面更多的肿瘤诊疗价值。粪菌移植治疗已在临床初见成效，我们设想就细菌毒力成分和相关致病机制使用特异性的靶点制剂，或将其与传统放化疗结合起来，以期提高治疗效果。但这之前，我们可能需要明确在肿瘤进展的不同阶段细菌的分布和作用是否具有差异性，以及这种分布和作用机制在不同性质的宿主个体间是否同质，这需要更多的大数据研究支持。同时，考虑到机体作为一个有机整体的高度复杂性，庞大的消化菌群之间也存在相互作用，目前多种病原体或病原体与健康菌群共存条件下致病能力和机制的研究尚不足。需更多且系统地研究，进一步探索交互环境下各种信号网络机制，以期为临床实践提供更有价值的参考策略。