先天性巨结肠细胞治疗研究进展

2023-12-02何雨晨蔡多特张书豪高志刚

安徽医学 2023年10期

何雨晨蔡多特张书豪金益高志刚邵敏

先天性巨结肠（Hirschsprung disease，HD）是一种肠神经系统发育障碍导致的先天性结构畸形，是造成新生儿和婴幼儿肠梗阻的主要原因，在全球新生儿的发病率约为1/5 000～1/3 500，亚洲人群发病率最高［1］。HD 是胚胎发育阶段远端肠道缺少神经细胞定植导致［2］，依据无神经节细胞肠段的长度可分为短段型、长段型和全结肠型［3］。目前，公认的HD 治疗方式仍是外科手术，通过外科手术可将无神经节细胞的肠段切除，并将正常肠段与肛管吻合。常用的根治手术术式有Swenson、Duhamel、Soave 和Rehbein 等［4］。近十年来，随着微创技术的推广，传统根治手术得到了改良，腹腔镜辅助技术使HD 根治术的解剖精度有了极大的飞跃，术后顽固性便秘和小肠结肠炎等并发症发生率在一定程度上改善，但仍不能彻底消除，而且大便失禁、泌尿系统损伤等手术导致的副损伤仍时有发生，一旦发生则严重影响HD 患者的术后生活质量［5］。非手术方式治疗HD 是一种减少手术创伤、避免手术副损伤的前沿医学研究，也是临床医师追寻期许的治疗新策略，细胞治疗就是其中一种，其潜在优势在于不仅可以有效规避外科手术相关的不良预后，还能最大程度地重建肠道神经结构以及恢复肠道功能，现已成为HD新治疗策略的研究热点［6］。本文拟从细胞来源、问题与挑战、总结与展望3 方面对HD 细胞治疗的研究进展进行综述。

1 细胞来源

再生医学的快速发展为HD 的治疗带来了一种基于细胞层面的新策略，目前可用于HD 治疗的细胞类型有多能干细胞（pluripotent stem cells，PSC）、肠神经嵴来源细胞（entericneural crest-derived cells，ENCDC）等。除此之外，Pan 等［7］发现来源于HD 患者无神经节细胞肠段表达PLP1 的施旺细胞拥有分化潜力，可以将其分化出的神经嵴细胞（enteric neural crest cells，ENCC）移植回HD 患者的肠段用于治疗。

1.1 PSC PSC 可分为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）和人胚胎干细胞（human pluripotent stem cells，hPSC），PSC 的增殖能力使其在细胞疗法中潜力巨大。相较于其他细胞来源的细胞治疗方法，PSC 的一个重要优势在于可以通过基因编辑（例如Crisper/Cas9 基因编辑技术）的方式纠正HD 相关的基因突变［8］，也为从基因水平研究HD 的发病机制提供了便利。早在2007 年，Takahashi 等［9］通过4 种逆转录因子——Oct3/4、Sox2、Klf4 以及c-Myc 将成人的体细胞重新编码为多能干细胞，且与hPSC 有着相似的形态、基因表达、端粒酶活性等。科学家为了减少HD 患者移植后机体的免疫排斥反应，尝试利用hPSC 对患者病变肠管进行细胞治疗，Fattahi 等［10］通过抑制hPSC 的转化生长因子β，将其分化为ENCC 并移植到HD 小鼠（Ednrbs-l/s-l），成功降低了小鼠HD 相关死亡率。Frith等［11］则在此基础上发现维A 酸可以更快速地通过抑制骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）水平，高效地在体外诱导出ENCC，并可在肠道内定植，优化了PSC 细胞来源的细胞治疗策略。虽然PSC 分化成ENCC 的速度得到了显著提升，但是PSC 分化方向的不确定性导致其诱导产生有效ENCC 的数量不足，这始终是困扰科学家们的一大难题。Lau 等［12］建立了一种新型的实验算法，可以为hPSC 分化成ENCC 提供指导，其发现Hedgehog 信号通路可以追踪未成熟的ENCC 过渡到成熟ENCC 以及从ENCC 发育成肠神经元的过程，在利用hPSC 对HD 患者进行细胞治疗时，可以利用这一算法指导ENCC 谱系以最大产量向着最适配的功能分化。而在全结肠型危重HD 的细胞治疗中，Fan 等［13］通过在HD 小鼠（Ednrb KO/NSG，肠道神经节细胞缺乏从结肠延伸到小肠）盲肠内注射hPSC 来源的迷走神经嵴细胞（vagal neural crest cells，VNC）和骶骨神经嵴细胞（sacral neural crest cells，SNC）的等比例混合液，显著延长了与单一注射VNC 或SNC 相比小鼠的存活时间，为全结肠型危重HD 患者的细胞治疗方法增添了新思路。

1.2 ENCDC 在肠道神经发育过程中，ENCDC 在肠管中受到遗传和环境因素影响，被多种信号通路调节（如一部分ENCDC 会表达结肠癌缺失基因（deleted in colorectal cancer，DCC）受体，其介导的轴突导向因子信号通路是ENCDC 在肠道进行放射状迁移到黏膜下肌层所必需的），从而沿着整个肠道进行增殖、分化并迁移，最终形成肠道神经元和神经胶质细胞［14］。近几年，已经有研究证实人类机体来源的ENCDC 移植入小鼠无神经节细胞的肠段，受肠段的微环境影响，移植的ENCDC 会向无神经节细胞的病变肠段迁移，改善HD小鼠的肠道症状，甚至能达到治愈的效果［15-17］。但是由于HD 肠道炎症和肠道菌群紊乱等原因，ENCDC 短期定植到HD 肠段会发生大规模的凋亡。Tian 等［18］研究发现借助粪便微生物可以增加短链脂肪酸通过MEK1/2 信号改善ENCDC 定植存活率低的问题。除此之外，也有科学家［19-20］提出调节HD 肠段内细胞生态位分子水平及细胞外基质-细胞相互作用，对维持ENCDC 移植发育的良好微环境，提高ENCDC 定植成功率有重大意义。国内外科学家对于ENCDC 的最佳来源也展开了各种研究。Cheng 等［21］研究发现，黏膜下和肌间神经丛的ENCDC 拥有相似的分化潜能，Wilkinson 等［22］研究团队从HD 无神经节细胞的肠段中分离出可以用来细胞治疗的ENCDC，且与正常肠段中分离出的ENCDC 一样具有分化和迁移能力。

目前，在模式动物中植入ENCDC 的相关研究已经取得较大进展，已经有报道［23］用野生型小鼠作为移植供体，成功地将表达ChR2 的神经元移植到HD 小鼠的无神经节区。显微注射技术是将分化完成的细胞移植到HD 模式动物肠管的主要方法，而内窥镜下的显微注射技术会给受体提供一个更安全、有效的细胞移植方式。Cheng 等［24］发现在内窥镜下进行显微注射比直接进行开放性手术更节约时间，且被移植小鼠未出现并发症。Cooper 等［15］则提出移植前的细胞准备程序是影响移植成功与否的重要一环，主要包括了检验移植细胞是否具有正常功能、是否能够安全移植等流程。针对移植ENCDC 的效率，Zhao 等［25］团队通过Y-27632 抑制ROCK 信号通路显著加速了ENCDC 在体内外的生长和迁移。

1.3 施旺细胞有研究表明，除了VNC 和SNC，施旺细胞前体也参与了肠道神经系统的形成，而胶质细胞源性神经营养因子（glial cell derived neurotrophie factor，GDNF）和内皮素3（endothelin 3，EDN3）则是起到了趋化引导肠道神经细胞在肠道内迁移定植的作用［26］。在肠道神经系统的发育过程被更多地研究背景下，Soret等［27］发现对HD 小鼠（HolTg/Tg、Ednrbs-l/s-l 以及雌性TashTTg/Tg）进行GDNF 灌肠，可以导致全结肠的内源性GDNF 和Ret 因子表达水平升高，促进神经元细胞的形成，全面改善结肠结构和功能。虽然对GDNF 诱导产生神经元细胞的机制了解尚不清楚，但是该研究发现有1/3 的新生神经元细胞来自外源性Dhh-Cre+施旺细胞。除此之外，研究者还发现以C57BL/6N 为遗传背景的HD 小鼠（HolTg/Tg）与以FVB/N 为遗传背景的HolTg/Tg小鼠相比，在进行GDNF 灌肠后会产生更为密集的肠道神经元细胞［28］。Pan 等［7］则利用细胞培养、活体细胞成像等研究成功完成了对在HD 患者无神经节肠段中定植表达PLP1 的施旺细胞的分离、扩增，再度证明了用施旺细胞诱导产生肠神经元细胞的可能性，为细胞治疗的细胞来源增添了新的选择。

2 问题与挑战

2.1 治疗效果近几年的研究发现，HD 患者不仅存在远端肠道神经缺失的现象［29-30］，还有Cajal 间质细胞的缺乏、内在B 淋巴细胞缺陷［31］、肠道菌群紊乱［32］等其他肠道改变。而目前HD 患者的细胞治疗策略主要针对的是远端肠道无神经定植的问题，细胞治疗能否同时矫治肠道神经缺乏之外的病变具有不确定性，因此细胞治疗是否能完全恢复HD 患者的肠道功能便成了亟待回答的问题。虽然Bhave 等［33］通过移植ENCC 到HD 小鼠缺乏肠道神经的肠段可以显著增加HD 小鼠的Cajal 间质细胞，解决HD 病变肠道Cajal 间质细胞缺乏的问题。但是Cajal 间质细胞数量的增加能否对HD 肠道蠕动功能的恢复提供帮助，相关研究仍然较少。同样，细胞治疗对HD 患者的免疫功能、肠道平滑肌功能等的影响作用也是不确定的。此外，细胞治疗过程中是否可以产生足够的肠道来源细胞，移植后是否可以发生有效的细胞迁移，使移植后的肠道神经细胞稳定定植在HD 病变肠段等问题，目前都有待进一步探索。

2.2 安全性评估细胞癌变主要发生在利用PSC 分化ENCC 的过程中，由于是通过人工技术化生或维持PSC 的，这些细胞的生存条件很大程度地偏离了生物体内自然环境，更容易发生染色体畸变、拷贝数变异或单核苷酸变异等突变，这成为其恶变倾向的主要因素［6，34］。因此，研究者想要从临床试验中得到细胞治疗是否会癌变的安全性评价，长时间的随访必不可少［6］。这种突变可在分化之前和分化之后发生，而分化之后发生的遗传物质改变更容易被忽略［35］。除此之外，细胞疗法的致癌性还可能与介导重新编码的因子持续在PSC 中保持活性有关，这进一步提高了基因突变的概率［35］。例如，介导体细胞重新编码为PSC 的逆转录因子c-Myc，正是最常见的癌变因子之一［9］。因此，安全性评估和如何有效控制细胞癌变是HD 细胞治疗亟待解决的关键性课题之一。

2.3 伦理道德虽然现在大部分细胞疗法的细胞来源都是自体细胞，但是在临床和科研的探索过程中，细胞疗法大多使用的还是同种异体的细胞，这就可能导致伦理道德问题的发生［36］。此外，采用损伤人类胚胎的代价来换取对某个疾病的缓解，这个伦理问题仍一直困扰着各种细胞治疗方案，这不仅仅是针对HD，也是导致近十年只有少数细胞疗法能通过监管批准进入市场的原因［37］。

临床试验之前风险收益比评估也是一项必要的伦理评价指标［38］。在现有接受根治手术的HD 患者中，总体优良存活率≥95%［39-40］，这就引发了这样一个问题：是否有必要在这些患者中开展首例人类细胞疗法临床试验？Alhawaj 等［37］对此提出了一个临床试验设想：将存在造瘘高风险的长段型巨结肠患者作为先期试验对象，将细胞治疗作为根治手术的辅助治疗方案，类似于晚期恶性肿瘤的术前化疗方案，这部分患者将有可能在细胞疗法试验中获益，减少肠造瘘概率，改善根治术前的生活质量，同时有望在试验成功时治愈疾病无需手术。