选择性MAO-B 抑制剂TM-5 对胶质瘤U87 细胞自噬和凋亡的影响

武海博 梁 燕 沈 雷 范 展 傅国惠

胶质瘤是一种病因不详、损伤性极大的中枢神经系统肿瘤，严重威胁人类健康［1］。手术治疗是目前临床医治恶性胶质瘤的主要方式，但脑胶质瘤细胞严重浸润周围正常脑组织，手术切除因需要确保神经功能和必要的生理功能而无法彻底清除肿瘤；患者术后改善效果不佳，存活率较低且极易复发［2-3］。由于胶质瘤细胞具有失控性增殖、侵袭性生长、细胞凋亡速度减慢等恶性细胞行为，也给胶质瘤的治疗带来巨大困难［4-5］。因此，寻找新的治疗药物防治胶质瘤，具有重要的临床实用价值。单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）存在于大多数哺乳动物，包括单胺氧化酶A （monoamine oxidase A，MAO-A）和单胺氧化酶B（monoamine oxidase B，MAO-B）两种同工酶，能够催化多种胺类（5-羟色胺、组胺、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素）氧化脱氨，导致神经递质失活［6］。研究显示，MAO-B 抑制剂对神经退行性疾病（如帕金森和阿尔茨海默症）具有潜在的治疗潜力［7］。在人胶质瘤中也检测到MAO-B 活性显著性增加，与正常星形胶质细胞相比，肿瘤来源的星形胶质细胞中MAO-B 的含量明显增高，其过表达可能与恶性胶质瘤有关［8-9］。因此，抑制MAO-B 将成为治疗胶质瘤的新靶点。笔者前期研究发现，新型查尔酮衍生物TM-5 可选择性抑制MAO-B 活性，其IC50为（0.022±0.01）μM（SI = 2618）［10］。但TM-5 是否可在胶质瘤中发挥抗肿瘤活性尚不清楚，本研究以人胶质瘤细胞株U87 为研究对象，观察TM-5 对U87 细胞存活的影响及可能作用机制，为恶性胶质瘤的新型药物开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人类胶质瘤细胞株U87，源于恶性神经胶质瘤，上皮样细胞，购自中科院上海生化所。

1.2 实验材料 DMEM/F12 培养基（货号：11320033，规格：500 mL，美国Gibco 公司）；胎牛血清（货号：BCSE-FBS01-500 mL，规格：500 mL，南京生航生物技术公司）；二甲基亚砜（货号：D5879，规格：100 mL，美国Sigma 公司）；噻唑蓝［3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT］试剂、SYBR荧光定量试剂盒（货号：C0009S、D7260-5mL，规格：500次、5 mL，上海碧云天生物技术公司）；异硫氰酸荧光素标记膜联蛋白V/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡试剂盒（货号：70-AP101-100，规格：100T，杭州联科生物技术有限公司）；反转录试剂盒（货号：K1622，规格：100 rxns，美国Thermo Scientific 公司）；兔源Bcl-2相关蛋白X（Bcl-2 associated protein X，Bax，货号：ab53154，免疫亲和纯化，浓度：1 mg/mL，规格：100 μg）、Beclin-1（货号：ab53154，蛋白A 纯化，浓度：0.634 mg/mL，规格：40 μg）、P62（货号：ab264313，免疫亲和纯化，浓度：1 mg/mL，规格：100 μg）、切割后半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3，货号：ab2302，免疫亲和纯化，浓度：0.5 mg/mL，规格：50 μg）、β-tubin（货号：ab179513，蛋白A 纯化，浓度：2.151 mg/mL，规格：40 μg）、鼠源自噬相关蛋白1 轻链-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ，货号：ab53154，蛋白A 纯化，浓度：0.43 mg/mL，规格：100 μg）蛋白一抗（美国Abcam 公司）；山羊源抗兔/鼠蛋白二抗（货号：CYZC04041、CYZ-C04042，规格：1 mg，武汉艾美捷科技公司）。流式细胞仪（型号：NovoCyte 2060R，杭州艾森生物有限公司），实时荧光定量PCR 仪（型号：Iq5，美国BIO-RAD 公司）。

1.3 方法

1.3.1 TM-5 的合成及配制 将3 mmol 5，6-二甲氧基茚酮和9 mmoL 50%氢氧化钾加入10 mL 乙醇中，室温搅拌30 min，再加入3.3 mmol 对二甲胺基苯甲醛，继续室温搅拌72 h，经薄层色谱法检测反应，将反应液倒入碎冰中，搅拌下调pH = 6，4℃下静置过夜，次日，抽滤，滤饼用乙醇重结晶，4℃下静置过夜，抽滤后将滤饼烘干，即得黄色目标化合物TM-5，其合成路线见图1。TM-5 分子式为 （Z）-2-［4-（二甲胺基）苯亚甲基］-5，6-二甲氧基-2，3-二氢-1H-茚1 酮［（Z）-2-（4-（Dimethylamino）benzylidene）-5，6-dimethoxy-2，3-dihydro-1H-inden-1-one （TM-5）］，浅黄色固体，熔点为117.8~119.1°C，收率为83.1%，纯度为98.6%。以二甲基亚砜为溶剂，再用pH 7.4 缓冲液梯度稀释，滤膜过滤除菌后备用。

图1 化合物TM-5的合成图示

1.3.2 细胞培养 预先配制含10% 胎牛血清、100 mg/L 链霉素和1×105U/L 青霉素的DMEM/F12 培养基（以下简称培养基），用适量培养基悬浮U87 细胞，设置培养条件为5% CO2、37 ℃，细胞贴壁生长繁殖至80%~90% 汇合度时传代培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3.3 MTT实验检测细胞活力 将U87 细胞以1×104个/mL 密度接种于96 孔板，100 μL/孔，每组3 个复孔，随机分为7 组：对照组不做处理，溶剂组待细胞贴壁后加入二甲基亚砜，5、10、25、50、100 μmoL/L TM-5 组待细胞贴壁后分别加入5、10、25、50、100 μmoL/L TM-5处理细胞，培养24 h，再加入0.5 mg/mL MTT 试剂每孔50 μL，继续孵育4 h，终止培养后加入二甲基亚砜 ，每孔100 μL，避光下放置摇床15 min，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪测量各孔的吸光度值（OD 492 nm），细胞存活率=测试组OD 值/对照组OD 值×100%，筛选细胞存活率＞50%的浓度进行后续实验。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡 将U87 细胞以1.0×105个/毫升接种于6 孔板，每孔1.5 mL，每组3 个复孔，按各组处理后培养24 h 收集细胞，调整细胞密度为1.0×106个/毫升，缓冲液洗涤两次，加入预冷1×结合缓冲液重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC 和PI 染液，避光下孵育10 min，再混入1×结合缓冲液，上流式细胞仪检测，右上象限（晚期凋亡细胞）与右下象限（早期凋亡细胞）细胞率之和为细胞凋亡率，再计算相对细胞凋亡率=测试组细胞凋亡率/对照组细胞凋亡率×100%。

1.3.5 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测细胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 水平 将U87 细胞以1.0×105个/毫升接种于6 孔板，每孔1.5 mL，每组3 个复孔，按各组处理后培养24 h 收集细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA 模板。构建qRT-PCR 反应体系：EvaGreen 2X qPCR MasterMix 5 μL、Forward Primer（10μM） 0.3 μL、Reverse Primer（10 μM） 0.3 μL、Nuclease-free H2O 3.4 μL、模板cDNA 1 μL，其中引物系列见表1。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72℃延伸30 s，72 ℃总延伸10 min，共40 个循环。以GAPDH 为内参，采用2-△△Ct法计算Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 表达水平，相对表达水平=测试组Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 表达水平/对照组Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 表达水平×100%。

表1 基因引物序列

1.3.6 蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）检测细胞中相关蛋白表达 将U87 细胞以1.0×105个/毫升接种于6 孔板，每孔1.5 mL，每组3 个复孔，按各组处理后培养24 h 收集细胞，提取细胞总蛋白，各组取40 μg 变性蛋白经10% SDS-PAGE 电泳分离，再电转至 PVDF膜，室温封闭1 h，添加蛋白一抗（稀释比1：1 000） 4℃过夜，加山羊源抗兔/鼠蛋白二抗室温孵育1 h，ECL 显色发光检测后显影，应用Image J 软件测定蛋白条带灰度值，计算Bax、LC3、Beclin 1、P62 和cleaved-caspase-3 蛋白条带灰度值与β-tubin 比值，表示目的蛋白表达量，蛋白相对表达量=测试组目的蛋白表达量/对照组目的蛋白表达量×100%。

1.4 统计学方法 应用SPSS 24.0 和GraphPad Prism5 软件进行统计学分析；符合正态分布数据以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TM-5 对U87 细胞活力的影响 MTT 实验结果显示，与对照组比较，用10、25、50、100 μmoL/L TM-5 处理后U87 细胞存活率降低（P<0.05）。见表2。选取细胞存活率＞50% 的浓度进行后续实验，即5、10、25 μmoL/L TM-5 组。

表2 各组U87细胞存活率比较（）

表2 各组U87细胞存活率比较（）

注：与对照组比较，①P < 0.05；与溶剂组比较，②P < 0.05；与5 μmoL/L TM-5组比较，③P < 0.05；与10 μmoL/L TM-5组比较，④P < 0.05；与25 μmoL/L TM-5组比较，⑤P < 0.05；与50 μmoL/L TM-5组比较，⑥P < 0.05。

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2.2 TM-5 对U87 细胞凋亡的影响 与对照组比较，10、25 μmoL/L TM-5 组U87 细胞相对细胞凋亡率升高（P<0.05）。见表3、图2。

表3 各组U87细胞相对细胞凋亡率比较（）

表3 各组U87细胞相对细胞凋亡率比较（）

注：与对照组比较，①P < 0.05；与溶剂组比较，②P < 0.05；与5 μmoL/L TM-5组比较，③P < 0.05；与10 μmoL/L TM-5组比较，④P < 0.05。

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图2 TM-5对U87细胞凋亡的影响（流式细胞术实验）

2.3 TM-5 对U87 细胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA 相对表达水平的影响 与对照组比较，5、10、25 μmoL/L TM-5 组U87 细胞中促凋亡基因Bax mRNA 相对表达水平升高，抑凋亡基因Bcl-2 mRNA 相对表达水平降低（P<0.05）。见表4。

表4 各组U87细胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA相对表达水平的比较（，%）

表4 各组U87细胞中Bax mRNA、Bcl-2 mRNA相对表达水平的比较（，%）

注：Bax为B细胞淋巴瘤/白血病-2基因相关X蛋白；Bcl-2为B细胞淋巴瘤/白血病-2基因；与对照组比较，①P < 0.05；与溶剂组比较，②P < 0.05；与5 μmoL/L TM-5组比较，③P < 0.05；与10 μmoL/L TM-5组比较，④P < 0.05。

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2.4 TM-5 对U87 细胞中自噬及凋亡相关蛋白相对表达量的影响 与对照组相比，5、10、25 μmoL/L TM-5组U87 细胞中Beclin-1 和cleaved caspase-3 蛋白相对表达量升高，P62 蛋白相对表达量降低（P<0.05）；10、25 μmoL/L TM-5 组LC3-Ⅱ和Bax 蛋白相对表达量升高（P<0.05）。见表5、图3。

表5 各组U87细胞中自噬及凋亡相关蛋白相对表达量比较（，%）

表5 各组U87细胞中自噬及凋亡相关蛋白相对表达量比较（，%）

注：Beclin-1为BH3域自噬蛋白；LC3-Ⅱ为微管相关蛋白轻链3 Ⅱ；P62为自噬选择性底物；Bax为B细胞淋巴瘤/白血病-2基因相关X蛋白；cleaved caspase-3为切割后天冬氨酸蛋白水解酶3；与对照组比较，①P < 0.05；与溶剂组比较，②P < 0.05；与5 μmoL/L TM-5组比较，③P < 0.05；与10 μmoL/L TM-5组比较，④P < 0.05。

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图3 TM-5对U87细胞中自噬及凋亡相关蛋白表达的影响（Western blot检测）

3 讨论

胶质瘤细胞生长速度快、破坏性强，急需开发新型药物帮助改善患者预后［11］。MAO 抑制剂是临床常用的抗抑郁药物，通过抑制MAO 的降解，提高突触有效介质浓度，发挥抗抑郁作用［12］。邵根宝等［13］研究发现，MAO 抑制剂可诱导胶质瘤U251 细胞分化，这将有助于提高胶质瘤的治疗效果；Marconi 等［14］发现，新型MAO-B 抑制剂—Cmp5 和Cmp3，可促进氧化应激，诱导细胞周期阻滞，并降低胶质瘤细胞迁移能力，从而在高级别胶质瘤发挥抗肿瘤作用。同时，Irwin 等［15］通过近红外荧光光学成像技术，发现静脉注射5 mg/kg MAO抑制剂是靶向脑肿瘤的最佳剂量，可安全用于胶质瘤的治疗。上述研究表明，MAO 抑制剂在胶质瘤的治疗中具有一定潜力。

笔者前期研究发现，合成新型MAO-B 抑制剂TM-5，在阿尔茨海默病中有良好的神经保护作用，但是否也可抑制胶质瘤尚不清楚［10］。本研究检测了人胶质瘤细胞株U87 在TM-5 处理后细胞增殖和凋亡的变化，结果显示，与对照组比较，10、25、50、100 μmoL/L TM-5 组细胞存活率降低，10、25 μmoL/L TM-5 组相对细胞凋亡率升高，提示MAO-B 抑制剂TM-5 对U87 细胞具有抑制作用。Inaba-Hasegawa 等［16］研究结果显示，MAO-B 可抑制胶质瘤细胞中神经保护基因表达，敲低其表达可调控Bcl-2、脑源性神经营养因子和胶质细胞系源性神经营养因子水平。由此提出猜测，TM-5可能通过调控Bcl-2 表达，在胶质瘤中发挥作用。本研究中，与对照组比较，5、10、25 μmoL/L TM-5 组U87细胞中促凋亡基因Bax mRNA 相对表达水平升高，抑凋亡基因Bcl-2 mRNA 相对表达水平降低，表明TM-5可能通过调控Bax、Bcl-2 基因表达，诱导细胞凋亡。

自噬是细胞完成细胞器更新和物质代谢的重要过程，对细胞凋亡有双向调节作用，营养物质缺乏的情况下，适度的自噬可促进细胞存活，但过量自噬会导致细胞死亡［17-18］。促凋亡信号因子刺激下细胞启动自噬，LC3-I 转化为 LC3-II 并转移至自噬体膜上，偶联P62蛋白参与自噬体的形成［19-20］。抑凋亡蛋白Bcl-2 也是重要的自噬调节因子，可结合自噬标识蛋白Beclin 1 并抑制其诱导的细胞自噬［21］。本研究中Western blot 检测发现，TM-5 可上调Beclin 1、LC3-Ⅱ表达，下调P62，诱导细胞自噬；同时，TM-5 处理后U87 细胞中Bax 和凋亡执行蛋白cleaved caspase-3 表达也升高，说明TM-5 可能通过调控上述蛋白表达，诱导U87 细胞自噬和凋亡，从而降低U87 细胞存活率。

综上所述，TM-5 可抑制胶质瘤U87 细胞存活，其作用机制可能是上调Beclin-1、LC3-Ⅱ、Bax 和cleaved caspase-3，下调Bcl-2 和P62 表达，诱导细胞自噬和凋亡。本研究提出新型化合物TM-5 有望成为治疗人胶质瘤的候选药物，但其是否存在其他作用途径还有待深入分析。