比率型荧光探针在重金属离子快速检测中的研究进展

李宁，武甜甜，李天歌，宋莲军，黄现青，BUKYEI Erkigul，王田林*

（1.河南农业大学 食品科学技术学院，河南 郑州 450000；2.蒙古国生命科学大学，蒙古国 乌兰巴托 999097）

过量的重金属在环境和生物体内积累，对人类健康和环境构成重大威胁，例如高血压、心血管疾病、帕金森病等。我国GB 2762—2022《食品安全国家标准食品中污染物限量》规定，饮用水中Pb 含量不得超过0.01 mg/L、Cd 含量不得超过0.005 mg/L、矿泉水中Hg含量不得超过0.001 mg/L[1]。美国环境保护署规定饮用水中Pb、Hg 和Cu 的最大允许量应少于72、10 nmol/L和20 μmol/L。世界卫生组织也规定饮用水中Pb、Hg的最高含量不能超过48 nmol/L 和30 nmol/L。因此，对食品中重金属含量的实时监测非常重要。

传统的金属离子检测方法有原子吸收光谱（atomic absorption spectroscopy，AAS）法[2]、原子发射光谱（atomic emission spectroscopy，AES）法[3]、电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spec-trometry，ICP-MS）法[4]、电感耦合等离子体原子发射光谱（inductively coupled plasma atomic emission spectros -copy，ICP-AES）法[5]、反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法[6]、电化学法[7]等。这些方法具有高准确性和高灵敏性的优点，但耗时较长，不能满足可视化快速检测的需求[8-9]。因此，寻求新的检测方法是必要的。

荧光法是一种以光为激发源的介于发射光谱法与吸收光谱法之间的光谱分析法。简单来说，用紫外光照射目标物时它们可受激发而发出荧光，测定发出的荧光能量即可对物质中的多种组分进行定量分析[10]。此外，荧光法具有分析速度快、样品需求量少以及操作简便等特点[11-12]。研究表明，荧光传感器作为利用荧光法的典型代表，在检测重金属离子方面的应用越来越广泛。荧光传感器具有高灵敏度、高准确性以及较低的检测限等优势。比率荧光传感器作为荧光传感器的一种，可以通过计算两个或多个发射的荧光强度比值，赋予自身自校准功能，具有良好的分辨率，提高了探针的灵敏度和可量化性[13]。同时，双发射或多发射的比率荧光强度检测可以有效弥补单波长发射检测的不足，如探针浓度、温度、溶剂极性、激发强度等环境因素[14]。此外，在一定浓度的物质中，比率荧光传感器观察到的颜色变化更为显著。因此，比率型荧光探针广泛应用于食品安全检测、环境污染、医学研究等领域[15-17]。

本文梳理了几种类型的比率型荧光探针在检测重金属中的研究进展，探讨了其在应用中面临的挑战和未来的发展趋势。

1 比率型荧光探针在重金属离子检测中的应用

1.1 以纳米材料为主体的比率型荧光传感器

金属纳米粒子、碳基纳米材料以及金属有机框架等纳米材料由于其高荧光产率、高热稳定性，耐光漂白性、小尺寸可调节，大的斯托克斯位移和良好的发光性能等荧光特性，以及较高的化学稳定性[18]，已经作为荧光纳米材料广泛应用于重金属离子的检测中[19]。He 等[20]利用量子点（quantum dots，QDs）与分析物之间的电子转移效应，设计了比率荧光探针CDs-QDx，实现了多种金属离子的同时检测。所设计的探针的原理是基于QDs 对不同目标分析物的尺寸大小依赖性荧光响应。通过结合碳点（carbon dots，CDs）和不同尺寸大小的CdTe QDs，对Hg2＋、Cu2＋和Ag＋进行定量检测，其线性检测范围分别为0～600、0～2 000 nmol/L 和0～1 000 nmol/L，检出限分别为22、57、45 nmol/L。Gao 等[21]基于氮掺杂的石墨烯量子点和谷胱甘肽（glutathione，GSH）包裹的金纳米团簇（Au nanoclusters，AuNCs）（glutathione-Au nanoclusters，GSH-AuNCs） 的静电相互作用构建了比率荧光探针—GQDs-AuNCs，用于定量检测Cu2+和Cd2+。检测Cu2+的原理是Cu2+与GSH 的羧基配合形成GSH-Cu2+配合物，电荷从GSH-AuNCs转移到Cu2+上，导致GSH-AuNCs 的荧光被猝灭；检测Cd2+的原理是由于Cd2+与GSH 的巯基形成GSHCd 配合物，使得GSH-AuNCs 表面钝化，有效地减少了非辐射衰减途径，导致荧光增强。其线性检测范围分别为0.08～6 μmol/L 和1～40 μmol/L，检出限分别为4.12 nmol/L 和0.943 μmol/L。Zhu 等[22]利用金原子和巯基之间的相互作用，将AuNCs 共价连接到QDs 的SiO2纳米颗粒表面，设计了一种新型的比率探针用于检测Pb2+。其检测原理是由于AuNCs 表面的谷胱甘肽与Pb2+结合，进而导致AuNCs 的荧光猝灭。Pb2+的线性检测范围为25～0.25 μmol/L，检出限为3.5 nmol/L。Wang 等[23]将氮钴（II）共掺杂碳点（CDs），包裹在铕金属有机骨架中，形成了一种比例荧光探针—CDs@Eu-MOFs，用于检测Hg2+。其检测原理归因于Hg2+与CDs@Eu-MOFs 之间的内滤效应（inner filter effect，IFE）。其线性检测范围为2～100 μmol/L，检出限为0.21 μmol/L。

以纳米材料为主体的比率型荧光探针的优点在于纳米材料的多样性，比如纳米材料之间可以通过静电相互作用、共价等方式进行结合，形成多种多样的比率型探针。另外，还可以在纳米材料表面修饰各种掺杂物，例如N-CDs、B-CDs、BSA-AuNCs、Eu-MOF等；其优点可以归因于纳米材料的易于获得性。据报道，已经有多种原料被开发用于CDs 的合成，例如竹叶、香蕉、橘子等任何含有C 元素的物质，都可以通过简单的水热法一步合成CDs。能够满足单一重金属和多种重金属同时检测的需求。

1.2 以DNA 为主体的比率型荧光传感器

脱氧核酶（deoxyribozyme，DNAzyme）是一种具有特异性识别能力的功能性核酸，在互补链的特定位置可以被金属离子剪切；适配体是一种短的单链脱氧核糖核酸（deoxyriboNucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）分子，具有结构稳定、易于合成和化学修饰等优势[24]。适配体能与靶标分子特定区通过氢键作用、静电作用、碱基堆积作用、范德华力以及构象互补等方式，形成发夹、G-四链体、颈环、假结等稳定的结构实现结合[25-26]。

常见的DNAzyme 比率型荧光探针多用于检测Pb2＋。Ji 等[27]开发了一种快速、高灵敏度和特异性检测Pb2＋的荧光传感策略，是将用于杂交链式反应（hybrid chain reaction，HCR）扩增的DNA 发夹在四面体DNA纳米结构（tetrahedral DNA nanostructure，TDN）的4 个顶点上进行修饰，然后利用发夹在引发链存在的情况下进行快速四面体DNA 纳米结构超支化杂交链反应（tetrahedral DNA nanostructure hyper-branched hybri -dization chain reaction，TDA-hHCR），产生大尺寸交联反应产物，从而大大提高荧光共振能量转移（fluores cence reso-nance energy transfer，FRET）信号输出。Pb2＋DNAzyme 催化引发链的裂解，抑制TDN-hHCR 的起始，并减弱FRET 信号。Pb2＋DNAzyme 催化的裂解反应和随后的TDN-hHCR 的协同信号放大使传感平台具有超高的灵敏度。通过使用信号“打开”或“关闭”模式，可以检测到低至0.25 pmol/L 的Pb2＋。此外，Jin 等[28]将DNAzyme 的底物链（S-DNA） 修饰在磁珠（magnetic beads，MBs）表面，然后将DNAzyme（E-DNA）的酶链与MBs 连接，与S-DNA 形成双链DNA（dsDNA）。用两端分别标记Cy3 和Cy5 的发夹DNA（HP）作为荧光探针检测Pb2＋。在Pb2+的存在下，由于DNAzyme 的裂解和单链DNA（ssDNA）的释放，HP 的发夹结构被打开，两个荧光团之间的FRET 消失，导致Cy3 信号增强，Cy5 信号减弱。随着Pb2+浓度的增加，荧光信号比逐渐增加。其线性检测范围为0.1～1 000 nmol/L，检出限为77 pmol/L。

Wu 等[29]通过引入DNA 插层染料（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚，DAPI）作为内部参考信号，构建了一个Pb2+诱导的基于G-四链体多态性的比率型荧光探针。该探针设计的关键在于协同利用G-四链体特异性染料（N-甲基介卟啉IX，NMM）和DAPI 两种信号报告器，其中，NMM 与K+稳定的G-四链体适配体（平行结构）结合。当加入Pb2+后，形成了比K+更稳定的Pb2+适配体的G-四链体（反平行结构），由于NMM 不与反平行的G-四链体结合，导致NMM 从体系中脱离，NMM的荧光强度降低，根据DAPI 和NMM 的荧光强度比可以定量检测Pb2＋。其线性检测范围为100～2 500 nmol/L，检出限为58.59 nmol/L。此外，Geng 等[30]同样利用这两种染料以及两端富含胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）的DNA序列的Hg2＋的特异性适配体，设计合成了用于检测Hg2＋的比率型荧光探针。在Hg2＋存在的情况下，由于TT 不匹配碱基对与Hg2＋之间具有特异性和强亲和力，富T 段与Hg2+协同配合，导致另一端的两个富G 段形成分裂的G-四链体。因此，DAPI 和NMM 的荧光染料分别选择性插入dsDNA 和G-四链体DNA，其荧光也相应增强。该荧光探针已成功检测牛胎血清中的Hg2＋含量。其线性检测范围为0.05～3.00 μmol/L，检出限为8 nmol/L。该类型传感器还可以检测水中的Hg2＋[31]。

以DNA 为主体的比率型荧光探针的优点在于目标物与适配体的特异性结合。例如DNAzyme 的特定位点切割，以及适配体与分析物的碱基互补配对特性。此外，DNAzyme 和适配体还可以结合各种纳米粒子或其他纳米材料，达到高效、快速检测重金属的效果。

1.3 以有机荧光染料为主体的比率型荧光传感器

有机荧光染料是指吸收某一波长的光后能发射出另一波长大于吸收光的物质，呈现鲜艳颜色，它们基本上都含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。有机荧光染料在电致发光、荧光探针、生物成像、防伪等领域有着广泛的应用。常见的有机荧光染料有氟化硼二吡咯（boron-dipyrromethene，BODIPY）、香豆素，罗丹明类等。染料类的比率型荧光探针多用来检测Hg2＋和Cu2＋。

例如Huang 等[32]报道了一种基于二炔基BODIPY的近红外荧光探针，利用光谱变化和肉眼实现了对两种金属离子Hg2＋和Cu2＋的检测。由于抑制分子内电荷转移过程，光谱显示出显著的蓝移吸收和荧光带。该探针与Hg2+或Cu2+结合后的荧光变化完全不同。其线性检测范围分别为6～78 μmol/L 和0～24 μmol/L，检出限分别为0.09 μmol/L 和1.02 μmol/L。此外，BODIPY 的比率型荧光探针还可以同时检测水中的Hg2＋和Cu2＋[33-34]。Wen 等[35]以BODIPY 为能量供体，罗丹明为能量受体，研制了一种新型的BODIPY-罗丹明比值荧光探针BR，用于Hg2+的检测。存在Hg2+时，Hg2+可以打开罗丹明的螺内酰胺环，进而导致BODIPY 和罗丹明之间发生FRET。其线性检测范围为0～8 μmol/L，检出限为0.3 μmol/L。此外，BR 探针已成功应用于试纸条上的Hg2+检测和活体Hela 细胞中的Hg2+成像。

Zhu 等[36]构建了一种新的以喹啉-苯并噻唑基为供体，罗丹明为受体的比值荧光探针1，用于Hg2+的荧光和比色检测。由于Hg2+促进了罗丹明肼的打开，从而导致罗丹明的荧光猝灭。其荧光线性检测范围为0～26 μmol/L，检出限为0.2 μmol/L。Zhang 等[37]利用FRET 机制，设计并合成了一种基于罗丹明和蒽基的比色、比例荧光探针1。探针1 在CH3CN ∶H2O（1 ∶1，体积比）体系中对Hg2+表现出优异的选择性。其检测原理可以归因于Hg2+可以使探针1 形成罗丹明酸形式，从而将非荧光罗丹明荧光团转化为开环强荧光形式，进而开启FRET 过程。此外，Zhang 等[38]还设计了一种基于黄蒽基和萘酰亚胺基的比色、比例荧光探针R1 用于检测Hg2+。其检测原理与探针1 类似：Hg2+可以使探针R1 形成氧杂蒽酸形式，从而将非荧光氧杂蒽荧光团转化为开环强荧光形式，开启FRET 过程。其线性检测范围分别为15～45 μmol/L 和0～60 μmol/L，检出限分别为0.81、1.14 μmol/L。Guo 等[39]采用二维COF（TAPT-DHTA-COF）作为宿主封装了掺氮碳点（NCDs）和罗丹明B（RhB）合成了比率型荧光探针—NCDs-RhB@COF。NCDs 和RhB 在TAPT-DHTA-COF 的孔隙中以氢键的方式均匀组装。加入Hg2＋后，由于NCDs-RhB@COF 和Hg2＋之间的强协同作用，蓝色发射减弱，而红色发射增强。这种“ON-OFF”荧光探针用于痕量Hg2＋的检测，其线性检测范围为0.048～10 mmol/L，检测限为15.9 nmol/L。Liu 等[40]提出了负载罗丹明B 的沸石咪唑酸骨架-8（ZIF-8）纳米复合材料—ZIF-8@-Rhodamine-B，用于检测Cu2+，其检测原理是ZIF-8 的咪唑中的吡啶氮能够识别Cu2+，并且Cu2+结合吡啶氮的能力比Zn2+强，进而代替Zn2+与吡啶氮结合，减少配体中心的电荷转移，从而降低了配体内的发光效率。该纳米复合荧光探针在68.4 nmol/L～125 μmol/L 范围内显示出良好的线性关系，检出限为22.8 nmol/L。

Cheng 等[41]利用Hg2+促进二硫缩醛和香豆素发色团的特殊脱保护反应，设计合成了针对Hg2+的新型比率型荧光探针C4。其检出限为90 nmol/L。Qin 等[42]设计和研制了一种新型的基于分子内电荷转移（intramolecular charge transfer，ICT） 的Hg2+比率荧光探针。该探针通过硫代香豆素与香豆素的特定汞促进脱硫反应进行操作，在几乎纯净的水溶液中表现出高选择性和灵敏度。其线性检测范围为0～1.5 μmol/L，检出限为1.85 μg/L。此外，该探针还成功地用于活细胞中Hg2+的荧光成像。

Wang 等[43]设计并合成了一种基于香豆素-罗丹明B 杂化物的比色比率荧光探针，用于识别Cu2+和精氨酸（Arg）。添加Cu2+后，香豆素基团（供体）与罗丹明B（受体）发生了FRET，进而可以根据490 nm 与615 nm处荧光强度变化定量检测Cu2+。其线性检测范围为0～60 μmol/L，检出限为0.47 μmol/L。

以有机荧光染料为主体的比率型荧光传感器的优点胜在荧光染料的易于获得，以及其结构特点，另外，荧光染料还可以通过各种方式与其他材料结合形成一种新的荧光传感器。

2 快速检测的实际应用

快速检测技术已经成为目前最有前景的研究方向之一，其中，荧光探针由于检测时间短，检测结果灵敏且便于观察等优点，被广泛应用于环境、食品、医学健康等方面。例如Wang 等[44]设计合成的B，N-CDs 荧光探针可以在8 min 内达到检测Cr6+的效果。何谐[45]合成的Tb（Ⅲ）修饰氮掺杂碳点的比率荧光探针可以在7 min 内检测水产品中的Hg2+。樊祢祢[46]合成的基于碳量子点和金纳米团簇的多色比率荧光探针能够在3 min内完成对Cu2+的检测。

此外，智能手机RGB 以及试纸条等辅助工具的产生，使得快速检测变得更为简单、便捷。例如Chen 等[47]开发了一种基于BODIPY 的新型荧光探针，将滤纸浸泡在该探针溶液中，经干燥之后得到的试纸条可以通过简单的颜色变化实现对Hg2+的检测。Wang 等[48]开发了一种与荧光探针相结合的试纸条，成功应用于水样中Cu2+的检测。Lu 等[49]提出了一种基于比率荧光分析的深度学习辅助的智能手机集成荧光传感平台，利用加样前后荧光不同的颜色变化，可以快速地定量检测水样中的Hg2+。

3 结论和展望

比率荧光传感器因为其高效性，检测的灵敏性以及较低的检测限在医学、环境、食品安全方面广受关注。本文主要介绍了3 种类型的比率型荧光传感器，分别以纳米材料、DNA、有机荧光染料为主体：1）以纳米材料为主体的比率型荧光探针因为其多样性和可修饰性一直是研究的热点，此外纳米材料还具有生物相容性好、体积小、量子产率高和多色发射等特点。目前对于纳米材料的研究已经十分透彻，急需新的纳米材料的开发；2）以DNA 为主体的比率型荧光探针由于其具有特定金属切割位点的DNAzyme 以及与目标分析物的碱基序列相配对的适配体链，可以达到高效特定识别的能力。但目前对于该类型的比率荧光探针的研究缺乏新意，没有令人眼前一亮的创新性研究；3）以有机荧光染料为主体的比率型荧光探针，其有机荧光染料通常表现出溶解性差、严重的光漂白和生物利用度差。此外，由于需要不同波长的光来激发染料，因此染料的窄激发不适合传感。

现如今，重金属污染问题非常普遍，通常微量存在于基质中，因此，良好的灵敏度对于它们的检测是必不可少的。鉴于目前的研究现状和挑战，可以从以下几个方面进行进一步的研究和开发：1）扩展新的比率测量模式，并合并现有的比率测量模型，以提高灵敏度、多目标量化和其他优异的检测性能；2）考虑到重金属污染在各种环境介质中普遍存在，扩大检测目标和样品的范围；3）提高实时跟踪检测能力，以全面预防和控制重金属污染；4）降低成本，达到重金属可视化快速检测的目的。