丹皮酚对大鼠肾缺血再灌注损伤的作用及其机制

申开文，张瑞波，王强，袁强，沈俊

（1.贵州医科大学附属医院泌尿外科，贵阳 550004；2.中山大学附属第一医院贵州医院泌尿外科，贵阳 550000）

肾缺血再灌注损伤 （renal ischemia reperfusion injury，RIRI） 是急性肾损伤 （acute kidney injury，AKI）的常见原因，也是影响肾移植术后存活率的关键因素。AKI 进展经常导致多器官衰竭和败血症，因此有必要开发有效的方法来预防或减轻RIRI［1］。细胞焦亡是RIRI的一个重要过程，是一种不同于细胞凋亡和坏死的促炎程序性细胞死亡，其特征是促炎细胞因子和细胞内容物的释放。抑制细胞焦亡可以减轻RIRI。Gasdermin D （GSDMD） 蛋白是细胞焦亡的关键效应蛋白。GSDMD的N末端由活性caspase 1或caspase 11产生，它们形成细胞膜孔，导致细胞死亡并释放成熟形式的白细胞介素 （interleukin，IL） -1β和IL-18，进而发生细胞焦亡［2-3］。Toll样受体4 （tolllike receptor 4，TLR4） 信号通路过度激活也是RIRI的一种机制，在RIRI大鼠模型中可观察到TLR4表达明显上调，导致TLR4下游信号分子MyD88和NF-κB激活，促炎细胞因子和趋化因子分泌增加［4］。

丹皮酚是从牡丹皮中提取的一种生物活性成分，具有广泛缓解动脉粥样硬化病变的药理特性，与改善内皮损伤、抑制血管平滑肌细胞及降低血脂有关［5］。除此之外，丹皮酚还具有抑制炎症反应、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用［6-8］。以往关于丹皮酚在RIRI中的重要作用主要集中在对肝脏、大脑及心脏方面的研究，目前，丹皮酚在RIRI中作用的研究鲜有报道。本研究应用丹皮酚干预后建立大鼠RIRI模型，探讨丹皮酚对大鼠RIRI的影响及其机制，旨在为临床防治RIRI提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

SPF级雄性SD大鼠30只，体质量170～200 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司 ［合格证号：SCXK （辽） 2020-0001］。大鼠于贵州医科大学实验动物中心饲养，饲养条件：湿度40%～70%、温度20～26 ℃、昼夜12 h明暗交替、自由饮水和进食。丹皮酚、TLR4抑制剂 （TAK242） 购于贵州明涵生物科技有限公司，HE 染液购于武汉阿斯本生物技术有限公司，血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN） 和血清肌酐 （serum creatinine，Scr） 检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，胱抑素C （cystatin C，CysC） 检测试剂盒、IL-1β和IL-18检测试剂盒购于科鹿 （武汉）生物科技有限责任公司。蛋白质印迹抗体，NLRP3、GSDMD、IL-1β 一抗购于英国 Abcam 公司，caspase 1购于江苏亲科生物研究中心有限公司，TLR4、IL-18一抗购于武汉三鹰生物技术有限公司，MyD88一抗购于美国CST公司，二抗均购于武汉阿斯本生物技术有限公司。免疫组化抗体，caspase 1、IL-18一抗购于武汉三鹰生物技术有限公司，TLR4，IL-1β 一抗购于美国 Affinity 公司，MyD88一抗购于英国Abcam公司，二抗均购于武汉塞维尔生物科技有限公司。

1.2 实验分组与RIRI模型建立

将30只SD大鼠适应性喂养7 d后随机分为 5 组：假手术组 （Sham组）、模型组 （RIRI 组）、丹皮酚组 （Pae组）、TLR4抑制剂组 （TAK242组） 和丹皮酚+ TLR4抑制剂组 （Pae+TAK242组），每组6只。本研究获得贵州医科大学动物伦理委员会批准。

大鼠术前8～12 h禁饮食。建模前2 h Pae组和Pae+TAK242组分别腹腔注射丹皮酚 （50 mg/kg）［9］，TAK242组和Pae+TAK242组大鼠分别腹腔注射TAK242 （3 mg/kg）［10］，Sham组和RIRI组大鼠腹腔注射等量生理盐水。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠 （50 mg/kg） 进行麻醉，麻醉生效后沿腹中线切开腹部，逐层分离皮肤、皮下组织进入腹腔，RIRI 组、Pae组、TAK242组和Pae+TAK242组大鼠暴露双侧肾蒂后用微型动脉夹钳夹住双肾肾蒂周围 45 min 后松开。通过肾脏颜色改变判断缺血及再灌注是否成功。Sham组大鼠手术进入腹腔后仅游离双侧肾蒂，但不夹闭肾蒂。术闭，各组大鼠缝合腹部切口后饲养24 h，麻醉处死后留取血清和肾组织进行后续实验。

1.3 检测方法

1.3.1 大鼠肾功能检查：采用试剂盒检测各组大鼠BUN、Scr和CysC水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）：采用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清IL-1β和IL-18水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 病理学检查：4%多聚甲醛固定肾组织标本24 h以上，脱水后包埋在石蜡中。石蜡切片脱蜡水洗后进行HE染色，通过光镜观察肾脏损伤情况。

1.3.4 免疫组织化学染色：肾组织石蜡切片脱蜡后水洗，抗原修复，封闭。一抗 （1∶300） 覆盖切片 4℃ 孵育过夜，洗涤后辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase，HRP） 偶联的山羊抗兔二抗 （1∶200） 孵育，显微镜控制下3，3’-二氨基联苯胺 （3，3’-diaminobenzidine，DAB） 染色，光学显微镜观察，MicroPublisher 获取图像，细胞核或胞质染色呈黄褐色为阳性染色。

1.3.5 Western blotting检测：提取各组大鼠肾组织蛋白，检测TLR4、MyD88以及焦亡相关蛋白 NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18的表达。一抗覆盖聚偏氟乙烯膜 4 ℃孵育过夜，洗涤后HRP偶联的二抗孵育 1 h。使用化学发光对印迹进行检测，采用Image J软件进行分析。

1.4 统计学分析

采用 GraphPad Prism 7.01 软件对数据进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹皮酚对RIRI后大鼠肾脏病理及肾功能的影响

HE染色结果显示，与 Sham组比较，RIRI组肾脏结构紊乱，肾小管上皮细胞严重变性坏死，Pae组及TAK242组肾小管上皮细胞轻度坏死，Pae联合TAK242组肾脏结构基本完整，少量细胞坏死 （图1）。RIRI组Scr、BUN和CysC水平较Sham组升高；Pae组、TAK242组及Pae组+TAK242组 Scr、BUN、CysC水平较RIRI组下降，差异均有统计学意义 （均P< 0.05），见图2。

图2 各组大鼠BUN、Scr、CysC水平比较Fig.2 Comparison of BUN，Scr，and CysC in each group

2.2 丹皮酚对大鼠RIRI后肾组织及血清炎性细胞因子的影响

各组大鼠RIRI后24 h免疫组化结果显示，与 Sham组比较，RIRI组、Pae组、TAK242组及Pae+TAK242组TLR4、MyD88、caspase 1、IL-18、IL-1β 表达增多；与RIRI比较，Pae 组、TAK242组及Pae+TAK242组TLR4、MyD88、caspase 1、IL-18、IL-1β 表达均减少，见图3。ELISA检测结果显示，与Sham组比较，Pae组、TAK242组及Pae+TAK242组IL-18、IL-1β水平均升高；与RIRI组比较，Pae组、TAK242组及Pae+TAK242组IL-18、IL-1β水平均降低，差异均有统计学意义 （均P< 0.05，图4）。

图5 各组大鼠TLR4、MyD88蛋白及焦亡相关蛋白表达Fig.5 Expression of TLR4，MyD88，and pyrodeath related proteins in each group

2.3 丹皮酚对大鼠RIRI后TLR4、MyD88蛋白及焦亡相关蛋白表达的影响

与Sham组比较，RIRI组中TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均升高；与RIRI组比较，Pae 组、TAK242组及Pae+TAK242组TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义 （均P< 0.05，图 5）。

3 讨论

RIRI是一个复杂的病理生理现象，RIRI过程中过量的活性氧引起氧化应激，继而引发缺血组织中脂质过氧化和细胞死亡。此外，炎症在RIRI中起着重要作用，缺血组织中DNA和蛋白质损伤引起凋亡、焦亡等程序性细胞死亡，伴随白细胞浸润和促炎细胞因子产生过多，进而加重肾脏组织损伤［11］。

细胞焦亡是由GSDMD蛋白介导的一种程序性细胞死亡方式，其特点是过度的细胞死亡和炎症。GSDMD在质膜上形成孔道，最终导致细胞肿胀、膜溶解和炎性细胞因子释放。已证实GSDMD蛋白介导的细胞焦亡是RIRI的必要过程［12］。细胞焦亡过程需要NLRP3炎症小体和 GSDMD蛋白共同参与，NLRP3炎症小体在细胞焦亡中同样至关重要。NLRP3炎症小体是一种细胞质多蛋白复合体，由先天免疫受体蛋白NLRP3、适配器蛋白ASC和炎症蛋白酶caspase 1组成，对微生物感染、内源性危险信号和环境刺激产生反应。组装的NLRP3炎症小体可以激活蛋白酶caspase 1，诱导GSDMD激活，促进IL-1β和IL-18释放，介导炎症反应，引起细胞焦亡［13］。本研究结果显示，与Sham组比较，RIRI组大鼠焦亡相关蛋白及炎性细胞因子明显升高，说明细胞焦亡在RIRI中发挥关键作用。与RIRI组比较，Pae 组、TAK242组及Pae+TAK242组TLR4、MyD88、NLRP3、caspase 1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达水平下降 （均P< 0.05），表明应用丹皮酚预处理可减轻RIRI引起的细胞焦亡。

TLR4是细胞膜Ⅰ型跨膜蛋白，能识别病原体相关的分子模式，通过细胞信号路径最终导致炎性细胞因子和趋化因子释放。已有研究［14-15］证明TLR4信号通路激活可以增加NLRP3炎症小体、caspase 1和促炎细胞因子的表达，从而诱导细胞焦亡。RIRI中TLR4触发了肾脏的炎症反应，加剧了肾组织损伤。

本研究结果显示，与Sham组比较，RIRI组大鼠炎性细胞因子释放增加，肾损伤加重。丹皮酚预处理大鼠细胞焦亡相关蛋白表达减少，肾脏组织损伤减轻及炎性细胞因子释放减少，效果与TAK242预处理相似。其机制可能是RIRI使TLR4信号通路活化，刺激NLRP3生成增多，产生大量细胞焦亡，诱发炎症风暴；而丹皮酚通过抑制TLR4-MyD88-NLRP3通路减少了细胞焦亡，发挥肾脏保护作用。

综上所述，本研究证实了丹皮酚可减轻大鼠RIRI，其机制可能是通过抑制TLR4-MyD88-NLRP3通路，从而抑制细胞焦亡实现的。因此，丹皮酚有可能成为未来RIRI精准治疗的新靶点。本研究仅为动物模型实验研究，丹皮酚调控TLR4-MyD88-NLRP3通路的具体机制需完善细胞实验来进一步论证。