2018—2021年中国部分省份牛病毒性腹泻病毒的流行病学调查

和彦良, 李真光, 苏玮玮, 郝艳霞, 武 华, 朱国强

[1. 扬州大学兽医学院, 江苏 扬州 225009 ; 2. 华威特(江苏)生物制药有限公司, 江苏 泰州 225300]

牛病毒性腹泻/黏膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一种以发热、腹泻、消化道黏膜糜烂和坏死、流产等为主要特征的接触性传染病[1-3]。BVDV进入机体后可破坏机体免疫系统,诱发免疫抑制[4]。妊娠母牛感染BVDV后可引起流产、死胎、畸形,怀孕的前3个月感染BVDV,可能会导致高比例的持续感染(Persistent infection,PI)牛出生[5-7],PI牛对感染的BVDV具有免疫耐受性,可终身带毒并排毒[8,9]。BVD自1946年在美国纽约首次被发现以来[10],已呈全球范围内流行,造成严重的经济损失[11]。1980年,李佑民等在国内首次分离得到BVDV[12],随后该病毒在全国范围内流行。Deng等对2010—2013年我国8个省份进行BVDV流行病学调查,BVDV抗体阳性率为78.09%,抗原阳性率为1.39%[13]。Deng等对2017—2019年我国19个省份92个奶牛场开展BVDV流行病学调查,BVDV抗原阳性率为2.22%[14]。随着我国养牛业的飞速发展,规模化养殖场BVDV的感染更为严重[15,16],很大程度上影响养牛业的可持续发展。

国际上防控BVDV的措施主要有两种,一种是筛查净化,一种是疫苗接种。瑞典、西班牙和芬兰等国采用筛查净化,很好地控制了BVDV的流行;美国和德国等国则采用疫苗免疫,也取得了显著的成效[17,18]。我国自2016年起有多家企业研制出BVDV疫苗,疫苗的安全性和有效性逐渐被广大养殖户认可。本试验于2018—2021年在国内8个主要养牛省份采集了5 270份血清样品和1 363份组织样品,分别进行BVDV抗体和核酸检测;同时持续性监测疫苗免疫牛群的BVDV中和抗体变化规律,旨在更新国内BVDV的流行数据,评价疫苗的免疫效果,为我国BVDV的防控提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 流行病学调查检测样品 2018—2021年在辽宁、吉林、河北等8个省份50个养牛集中地区的规模化养牛场采集血清样品5 270份和组织样品1 363份,分别用于BVDV抗体和核酸检测,样品采集信息见表1、2,样品来源牛场的牛只多存在呼吸道和消化道疾病散发。

表1 2018—2021年不同省份血清样品采集信息

表2 2018—2021年不同省份组织样品采集信息

1.2 中和抗体检测样品 2018—2021年在河北、山东和河南等6个省份的BVDV疫苗接种场采集血清样品1 449份,用于BVDV中和抗体监测,样品采集信息见表3。牛场使用的BVDV疫苗均为BVDV1型灭活疫苗,主要有牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗(1型,NM01株)、牛病毒性腹泻/黏膜病、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(1型,NM01株+LN01/08株)和牛病毒性腹泻/黏膜病、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗(NMG株+LY株)。免疫程序牛场间存在一定差异,但多为犊牛3月龄免疫接种1次,4月龄加强接种1次,母牛配种前1个月接种1次,产前2个月接种1次,每头牛1头份/次。

表3 2018—2021年不同省份中和抗体检测用血清样品采集信息

1.3 主要试剂和细胞 BVDV荧光定量PCR检测试剂盒,购自易瑞生物技术股份有限公司;BVDV ELISA抗体检测试剂盒,购自IDEXX公司。牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)和BVDV1 NM01株中和抗原,均由华威特(江苏)生物制药有限公司提供。

1.4 主要仪器 实时荧光定量PCR仪,购自赛默飞世尔科技公司;生物安全柜,购自苏州安泰空气技术有限公司;二氧化碳培养箱,购自日本松下健康医疗器械株式会社;酶标仪,购自美国伯乐公司;离心机和微量移液器,购自德国艾本德(Eppendorf)有限公司。

1.5 BVDV ELISA抗体检测 按照BVDV ELISA抗体检测试剂盒说明书的操作步骤和判定方法进行BVDV ELISA抗体检测。

1.6 BVDV核酸检测 按照BVDV荧光定量PCR试剂盒说明书的操作步骤和判定方法进行BVDV核酸检测。

1.7 BVDV中和抗体检测 利用微量血清中和试验进行血清中和效价(Serum neutralization titer,SN)测定。将待检血清56 ℃灭活30 min,在96孔U型板用DMEM培养基做2倍倍比稀释,100 μL/孔;将BVDV1 NM01株中和抗原用DMEM培养基稀释至200 TCID50/0.1 mL,加入96孔U型板,100 μL/孔,充分混匀,置37 ℃中和1 h,依次将96孔U型板中的血清和抗原混合液移至长满MDBK细胞的96孔细胞板,100 μL/孔,置37 ℃、5% CO2培养箱培养4 d。每天观察细胞病变,接种后第4天进行中和抗体效价判定。

2 结果

2.1 BVDV血清学调查 采集的5 270份血清样品中,检出BVDV抗体阳性样品4 131份,阳性率为78.39%。按省份划分,河北BVDV抗体阳性率最高,为90.03%(623/692);甘肃BVDV抗体阳性率最低,为70.95%(525/740);其余省份抗体阳性率介于72.28%～85.23%(表4)。

表4 不同省份BVDV抗体检测

2.2 BVDV流行趋势 按时间分析,2018年、2019年、2020年和2021年调查区域牛群总体BVDV抗体阳性率分别为75.59%(1 743/2 306)、75.44%(1 189/1 576)、86.24%(733/850)和86.62%(466/538),呈上升趋势,其中山东BVDV抗体阳性率上升趋势明显,甘肃BVDV抗体阳性率呈下降趋势,其余各省份变化趋势不规律,呈上下波动(表5和图1)。

图1 2018—2021年牛群总体BVDV抗体阳性率变化趋势

2.3 BVDV核酸调查 采集1 363份组织样品中,检出BVDV核酸阳性样品98份,阳性率为7.19%。按省份划分,河北BVDV核酸阳性率最高,为20.71%(29/140);其次依次是江苏、河南、吉林、甘肃、宁夏和辽宁;山东BVDV核酸阳性率最低,为1.17%(3/257)(表6)。按时间分析,2018年、2019年、2020年和2021年调查区域牛群总体BVDV核酸阳性率分别为5.78%(19/329)、7.96%(46/578)、3.57%(9/252)和11.76%(24/204),总体呈上升趋势;2021年的BVDV核酸阳性率最高,超过10.00%(表7和图2)。

表6 不同省份BVDV核酸检测

表7 2018—2021年牛群总体BVDV核酸检测

2.4 免疫牛群BVDV中和抗体监测 在疫苗免疫牛群采集的1 449份血清样本中,BVDV的SN≤1∶4的比例为4.49%(65/1 449),SN介于1∶8～1∶16的比例为5.04%(73/1 449),SN介于1∶128～1∶512的比例为24.78%(359/1 449),SN≥1∶1 024的比例为65.70%(952/1 449),牛群中BVDV的SN≥1∶128的比例达到了90.48%(1 311/1 449)(表8和图3)。按时间分析,2018年、2019年、2020年和2021年调查区域牛群整体的BVDV中和抗体效价的平均值分别为1∶938.2、1∶1 026.6、1∶1 077.6和1∶1 579.3,抗体水平呈逐年上升趋势;免疫牛群BVDV的SN逐渐集中分布在1∶1 000～1∶2 000(图4)。

图3 疫苗免疫牛群BVDV中和抗体水平总体分布

表8 2018—2021年疫苗免疫牛群BVDV中和抗体效价的分布

3 讨论

我国是世界第三的养牛大国,2021年牛存栏量达9 817万头。近年来,随着我国规模化和集约化养牛业的快速发展,跨国家或地区的引种和调运频繁,致使BVDV在国内的流行越来越严重,BVD已成为影响我国养牛业发展的重要疫病之一[19-21]。BVDV的传播以垂直传播和水平传播为主,垂直传播途径母畜可直接将病毒传染给胎儿;水平传播途径较多,如飞沫传播、共用料槽、管理措施不当均可造成BVDV的水平传播[22]。国内外诸多研究证明,BVDV可感染多种动物,例如牛、羊、猪、骆驼和鹿等,跨物种间的传播增加了BVD的防控和净化难度[23,24]。目前,我国缺乏完善的生物防范制度,BVDV的传播未得到有效控制,总体流行范围和感染数量呈现上升态势。国内养牛业中规模化养殖和个体散养混杂,难以采用筛选净化的方式防控BVDV,疫苗接种则是一种廉价、可行和有效的方法。

本试验通过调查2018—2021年国内主要养牛地区的BVDV流行现状,更新了BVDV在我国的流行病学数据,调查区域内牛群BVDV的抗体阳性率介于70.95%～90.03%,核酸阳性率介于1.17%～20.71%;抗体和核酸阳性率总体呈逐年上升趋势,BVDV流行日趋严重,抗体阴性牛势必会成为感染的对象。为给我国BVDV的防控提供借鉴和参考,本试验持续性监测2018—2021年BVDV疫苗免疫牛群的BVDV中和抗体的变化规律,结果显示,BVDV疫苗免疫牛群的BVDV中和抗体水平呈逐年上升趋势,90.48%的牛群BVDV中和抗体效价不低于1∶128。疫苗的免疫接种在很大程度上提高了牛群的整体免疫水平,但牛群中仍有少数牛呈BVDV抗体阴性,牛场需加强牛群的免疫效果监测。本试验通过分析国内主要养牛省份BVDV的流行现状,结合疫苗免疫效果的持续性监测,证实疫病监测和疫苗免疫接种是当前形势下我国BVDV防控的关键。