指纹图谱结合一测多评法评价山楂叶质量Δ

李艳荣 ，段丽颖 ，魏 红 ，杜义龙 ，赵胜男 ，高 晗 ，潘海峰 #（.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000；.北京工业大学医院药剂科，北京 004；.神威药业集团有限公司，石家庄 0540）

山楂叶是蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥叶，具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂之功效[1]。现代研究表明，山楂叶主要含有黄酮类、萜类和有机酸类等化合物[2―3]，具有抗动脉粥样硬化、降压降脂、增加冠状动脉血流量等药理活性[4―5]，在心脑血管疾病治疗领域效果突出[6]。2020年版《中国药典》（一部）以金丝桃苷含量作为山楂叶药材的定量指标[1]。由于中药大多具有化学成分多、作用机制复杂、治疗效果多样等特点，因此单一成分难以全面反映药材质量，需要对药材质量进行整体控制[7]。指纹图谱是符合中药特点的质量控制模式之一，能够较全面地反映中药所含化学成分的种类和数量，从而体现中药的整体性和复杂性[8]。但指纹图谱无法表征已知成分的含量[9]，故在其基础上进行多组分含量测定可以弥补上述不足。多组分含量测定多用外标法，但由于对照品价格昂贵、难以获得，使得检测成本较高。一测多评（quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS）法只需定量分析1个成分（内参物）即可实现多成分含量的同时测定[10]，可有效解决对照品紧缺和检测成本高的问题。基于此，本研究对河北省承德市、辽宁省葫芦岛市、山西省运城市、山东省临沂市4 个主产地的78 批山楂叶药材进行指纹图谱研究和灰色关联分析（grey correlation analysis，GCA）、聚类分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），采用QAMS 法检测药材中5 种主要有效成分（绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素[4―5]）的含量，评价不同产地山楂叶的质量并筛选影响其质量的差异标志物，以期为全面评价山楂叶药材质量提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Agilent 1200型高效液相色谱（HPLC）仪（美国Agilent公司）、KQ-700型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、AG-254 型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、HC-2062型高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）等。

1.2 主要药品与试剂

绿原酸对照品（批号18071907）、牡荆素葡萄糖苷对照品（批号20042305）、牡荆素鼠李糖苷对照品（批号20042304）、金丝桃苷对照品（批号19103001）、异槲皮素对照品（批号18062702）均购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均不低于98.0%；乙腈、四氢呋喃、甲酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

78 批山楂叶药材（编号S1～S78）分别来自河北省承德市、山东省临沂市、辽宁省葫芦岛市、山西省运城市4 个主产地，经全国老中医药专家（传统鉴定）学术经验继承人孙宝惠主任药师鉴定，均为山里红C.pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.的干燥叶。78 批药材采自2020年10－11月和2021年10－11月，分别产自河北省承德市隆化县（编号S1、S4、S8、S10、S19、S22、S26、S28、S37、S39、S42、S44、S63～S67、S76～S78）、河北省承德市承德县（编号S2、S3、S6、S7、S20、S21、S24、S25、S38、S41、S60～S62）、河北省承德市滦平县（编号S9、S27、S43）、河北省承德市兴隆县（S5、S23、S40）、河北省承德市鹰手营子镇（编号S45）、辽宁省葫芦岛市建昌县（编号S12～S14、S29～S31、S50～S54、S68～S70）、山东省临沂市费县（编号S11、S46～S49）、山西省运城市夏县（编号S15～S18、S32～S36、S55～S59、S71～S75）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-四氢呋喃混合溶液（体积比12∶1）为流动相A、0.3%甲酸溶液为流动相B进行梯度洗脱（0～15 min，8%A→12%A；15～25 min，12%A→16%A；25～38 min，16%A→15%A；38～45 min，15%A→20%A；45～50 min，20%A→34%A；50～55 min，34%A→100%A）；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为363 nm；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液

取绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为1.02、1.02、1.07、1.04、0.41 mg/mL 的单一对照品储备液。分别取上述单一对照品储备液适量，置于10 mL容量瓶中，以50%甲醇稀释，制成每1 mL 含绿原酸75.33 μg、牡荆素葡萄糖苷80.18 μg、牡荆素鼠李糖苷115.77 μg、金丝桃苷35.26 μg、异槲皮素12.40 μg的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液

取山楂叶药材，粉碎，取粉末（过80 目筛）约1.0 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，称重，超声（频率40 kHz，功率700 W，下同）提取30 min，放至室温后再次称重，用60%甲醇补足失重，静置，以12 000 r/min 离心10 min，取上清液，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 指纹图谱分析

2.3.1 方法学考察

（1）精密度试验：取山楂叶供试品溶液（编号S43），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以峰4（保留时间适中且峰面积较大，下同）为参照峰，计算得各共有峰相对峰面积的RSD 均小于1.9%，各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.2%（n＝6），表明方法精密度良好。

（2）重复性试验：取山楂叶药材（编号S43），粉碎，取粉末6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以峰4为参照峰，计算得各共有峰相对峰面积的RSD均小于1.6%，各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.2%（n＝6），表明方法重复性良好。

（3）稳定性试验：取山楂叶供试品溶液（编号S43），分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。以峰4为参照峰，计算得各共有峰相对峰面积的RSD 均小于1.9%，各共有峰相对保留时间的RSD 均小于0.2%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.3.2 指纹图谱建立、共有峰指认和相似度评价

取78批山楂叶药材样品，粉碎，取粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。将图谱结果以“AIA”格式导出，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》，以S1样品图谱为参照，设定时间窗宽度为0.2 min，以中位数法结合多点校正，生成叠加指纹图谱和对照指纹图谱（R），具体见图1。共标定共有峰8 个，经对比混合对照品溶液色谱图（同法进样所得，具体见图2），指认了其中5个，分别为绿原酸（峰1）、牡荆素葡萄糖苷（峰3）、牡荆素鼠李糖苷（峰4）、金丝桃苷（峰7）、异槲皮素（峰8）。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》进行相似度评价，结果（表1）显示，78批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度为0.871～0.998。

表1 78批山楂叶样品相似度评价及GCA分析结果

图1 78批山楂叶药材的HPLC叠加指纹图谱和对照指纹图谱（R）

图2 混合对照品溶液的HPLC图

2.3.3 指纹图谱的化学模式识别分析

（1）GCA：以78 批山楂叶药材的8 个共有峰峰面积（采用均值法进行归一化处理）为评价指标并构建单元序列，选择最优参考序列和最差参考序列（其中最优、最差参考序列分别是所有样品的最大、最小值），计算各评价单元相对于最优、最差参考序列的相对最优、最差关联度及相对关联度，并对相对关联度进行排序，其中相对关联度大的样品质量较优[11]。结果（表1）显示，不同产地山楂叶药材的相对关联度为0.382～0.645，排前3位的S3、S7、S77 样品均产自河北省承德市。78 批样品中，河北省承德市、辽宁省葫芦岛市、山西省运城市、山东省临沂市样品的平均相对关联度分别为0.538、0.528、0.462、0.435。由此可知，河北省承德市样品的质量整体较优，其次为辽宁省葫芦岛市、山西省运城市、山东省临沂市样品。

（2）CA：CA 热图可对数据进行筛选、提取和降维，通过横向聚类来反映各样品之间的关系，纵向聚类来反映各化学成分之间的关系，该图通过渐变的蓝红色条来直观呈现数据结果，成分含量越高则条带颜色越红，反之越蓝[12]。本研究将4个主产地（河北省承德市、辽宁省葫芦岛市、山东省临沂市、山西省运城市）的78批山楂叶药材的8 个共有峰峰面积导入MetaboAnalyst 5.0 工具，相关数据经筛选、归一化处理后，得到CA热图（图3A）。由图3A可见，78批样品可分为2类，河北省承德市和辽宁省葫芦岛市样品大致分为一类，山东省临沂市和山西省运城市样品大致分为一类；结合热图的条带颜色可知，河北省承德市和辽宁省葫芦岛市样品中峰1、3、5、6、7、8 代表成分含量较高，山东省临沂市和山西省运城市样品中这6个成分含量则较低。

图3 78批山楂叶药材的CA热图和PCA得分图

（3）PCA：采用SPSS 19.0 软件，以78 批山楂叶药材的8 个共有峰峰面积为变量进行PCA，并进行KMO 检验及Bartlett 球形检验。结果显示，KMO 度量值为0.616，Bartlett 球形检验的P＜0.001，可进行PCA[13]。将8 个共有峰峰面积导入MetaboAnalyst 5.0 工具，相关数据经筛选、归一化处理后，得到PCA得分图（图3B）。由图3B 可见，河北省承德市和辽宁省葫芦岛市样品大致可分为一类，山东省临沂市和山西省运城市样品大致可分为一类，与CA热图结果基本一致。

（4）OPLS-DA：为进一步明确差异标志物，本研究将78 批山楂叶药材的8 个共有峰峰面积导入SIMCA 14.1软件，建立OPLS-DA模型。由模型验证参数可知，模型的稳定性较好（R2X＝0.843，R2Y＝0.725）且交叉验证预测能力较强（Q2＝0.532）[14]。置换检验的R2拟合直线在Y坐标轴上的截距为0.049 6（＜0.3），说明所建模型可靠；Q2拟合直线在Y坐标轴上的截距为－0.188 0（＜0.05），说明所建模型不存在过度拟合，可用于分析样品的组间差异[15]。提取OPLS-DA 模型中8 个共有峰的变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值，以VIP 值＞1 且误差线不超过原点为标准[16]进行差异标志物筛选，结果（图4）显示，峰1（绿原酸）、峰2、峰3（牡荆素葡萄糖苷）、峰5的VIP值均大于1，其对应成分为差异标志物，可能是影响山楂叶药材质量的主要化学成分。

图4 78批山楂叶药材8个共有峰的VIP值

2.4 5种有效成分含量的测定

2.4.1 方法学考察

（1）专属性试验：取山楂叶供试品溶液（编号S43）、混合对照品溶液和空白溶液（60%甲醇），按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图（图略）。结果显示，空白溶液对各待测成分的测定无干扰，表明方法专属性良好。

（2）线性关系考察：精密吸取“2.2.1”项下5种单一对照品储备液各适量，置于同一10 mL 容量瓶中，以50%甲醇溶解并稀释，制成每1 mL含绿原酸192.00 μg、牡荆素葡萄糖苷204.00 μg、牡荆素鼠李糖苷300.00 μg、金丝桃苷131.82 μg、异槲皮素64.36 μg 的混合对照品溶液，记为1号混合对照品溶液；取1号混合对照品溶液适量，用50%甲醇分别稀释2、4、8、16、32、64、128 倍，分别记为2～8号混合对照品溶液。分别取上述1～8号混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以待测成分质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表2。

表2 5种待测成分的回归方程与线性范围

（3）精密度试验：取山楂叶供试品溶液（编号S43），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素峰面积的RSD 分别为0.41%、0.29%、0.36%、0.39%、0.53%（n＝6），表明方法精密度良好。

（4）重复性试验：精密称取山楂叶药材样品（编号S43），共6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并按外标法计算各成分含量。结果显示，绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素含量的RSD分别为1.57%、2.48%、2.34%、2.44%、1.93%（n＝6），表明方法重复性良好。

（5）稳定性试验：取山楂叶供试品溶液（编号S43），分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果显示，绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素峰面积的RSD 分别为0.63%、0.56%、0.84%、0.66%、1.29%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

（6）加样回收率试验：取已知含量的山楂叶药材样品（编号S43）约0.5 g，共6 份，精密称定，分别加入单一对照品储备液适量（加入量与已知量相等），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并计算加样回收率。结果显示，绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素的平均加样回收率分别为97.37%、101.44%、102.18%、96.79%、102.00%，RSD 分别为0.51%、0.67%、0.46%、0.72%、2.67%（n＝6），表明方法准确度良好。

2.4.2 相对校正因子的计算

以牡荆素鼠李糖苷为内参物（含量较高），取“2.4.1（2）”项下1～8 号混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积并按下式计算相对校正因子（fK/S）：fK/S＝（CK×AS）/（CS×AK）（CS为内参物的质量浓度，AS为内参物的峰面积，Ck为待测成分的质量浓度，Ak为待测成分的峰面积）。结果显示，绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷、异槲皮素的平均相对校正因子分别为0.401、0.993、1.670、1.615，RSD 分别为1.58%、0.64%、0.38%、0.39%（n＝8）。

2.4.3 不同试验条件对相对校正因子的影响

取“2.4.1（2）”项下1～8号混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，考察不同仪器（Agilent 1200、1100、1220 型HPLC 仪）、不同色谱柱[Agilent ZORBAX SB-C18、Agilent 5 HC-C18（2）、Shiseido CAPCELL PAKC18，规格一致]、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱温（25、30、35 ℃）对相对校正因子的影响。结果显示，在上述条件下，绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷、异槲皮素的相对校正因子分别为0.374～0.404、0.979～1.003、1.626～1.725、1.579～1.647，RSD 分别为2.32%、0.67%、1.56%、1.24%（n＝12），表明方法耐用性良好。

2.4.4 色谱峰定位

采用相对保留时间法进行色谱峰定位。取“2.4.1（2）”项下1～8 号混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以牡荆素鼠李糖苷为内参物，计算其余4个成分的相对保留时间。结果显示，绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷、异槲皮素的相对保留时间分别为0.422、0.930、1.540、1.218，RSD 分别为0.04%、0.02%、0.04%、0.15%（n＝8）。

2.4.5 样品含量测定及比较

取78 批山楂叶药材的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，分别采用外标法和QAMS 法计算5 种成分的含量（内参物含量仅以外标法计算），并计算2 种方法结果的相对偏差（relative deviation，RD）。各样品平行测定2 次，结果以平均值展示。结果（图5）显示，78 批样品中，4 种成分的2 种方法含量测定结果较接近，除2批样品（S39和S41）中异槲皮素含量的RD值超过5%外，其余成分含量的RD值均不高于5%，提示2种检测方法结果无明显差异。

图5 78批山楂叶药材中5种有效成分含量的QAMS法与外标法测定结果比较（n＝2）

3 讨论

3.1 指纹图谱结果分析

我国山楂栽培产地大致可分为京津冀、吉辽、中原等五大产区，主要产地有河北、辽宁、吉林、山东、山西等地[17]。本研究收集了2020年10－11月、2021年10－11月河北省承德市、山东省临沂市、辽宁省葫芦岛市、山西省运城市4个山楂叶主产地的78批样品，样品跨越2个年份且样品量充足，具有一定的代表性。中药指纹图谱具有整体性、全面性和系统性特点，能够全面反映中药材和中成药的质量[18]。本研究通过考察提取溶剂、提取方法、提取时间和色谱柱、流速、柱温、流动相比例等条件，对供试品溶液制备和色谱条件进行了优化，并建立了78 批山楂叶药材的指纹图谱，确定了8 个共有峰，指认了其中5个成分；各批样品的相似度为0.871～0.998，提示4个产地的山楂叶药材存在一定差异。本研究所建指纹图谱简单、易行，且HPLC法普适性强，可用于山楂叶药材的质量评价。

3.2 化学模式识别结果分析

指纹图谱结合化学模式识别能真实、形象地反映中药的质量差异，揭示其复杂成分之间的潜在规律，已被广泛用于中药质量控制及差异标志物的筛选[12]。GCA结果显示，78 批样品中，相对关联度为0.382～0.645，排前3位的S3、S7、S77样品均产自河北省承德市。各产地的平均相对关联度分别为河北省承德市0.538、辽宁省葫芦岛市0.528、山西省运城市0.462、山东省临沂市0.435，即药材质量优劣排序为河北省承德市、辽宁省葫芦岛市、山西省运城市、山东省临沂市样品。CA热图显示，78 批样品可分为2 类，河北省承德市和辽宁省葫芦岛市样品大致分为一类，山西省运城市和山东省临沂市样品大致分为一类；PCA 分类结果与聚类分析结果一致。笔者分析认为，分类结果可能与海拔、经纬度、光照、气候等药材生长环境因素有关。OPLS-DA 结果显示，峰1（绿原酸）、峰2、峰3（牡荆素葡萄糖苷）、峰5 的VIP 值均大于1，表明其对应成分可能是影响山楂叶药材质量的差异标志物，后续可对上述2个未知成分进行鉴定，有助于对药材进行全面质量控制和溯源。同时，本研究结果提示，在控制山楂叶药材质量时，可考虑增加含量较高的共有性成分（如牡荆素鼠李糖苷）和差异性成分（如牡荆素葡萄糖苷）作为检测指标，从而更科学、全面地评价不同产地山楂叶药材的品质。

3.3 含量测定结果分析

中药成分复杂，具有多成分、多靶点作用的特点，仅用单一成分无法全面表征其质量的优劣，而多成分检测因对照品不易获得、价格昂贵、溶液配制耗时等不足导致检测成本较高。山楂叶的主要有效成分为黄酮类化合物，牡荆素鼠李糖苷为山楂叶中含量较高的共有性成分[4―5]，故本研究以该成分为内参物，同时测定了绿原酸、牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷和异槲皮素的含量。本研究结果显示，不同仪器、色谱柱、流速、柱温条件下，各成分相对校正因子的RSD 均小于2.5%；外标法与QAMS 法比较，除2 批样品（S39、S41）中异槲皮素含量的RD 值超过5%外，其余成分的测定结果均无明显差异，说明QAMS法可用于山楂叶药材中多种有效成分的含量测定。

综上，所建HPLC 指纹图谱结合QAMS 法操作简单，可用于山楂叶药材的质量评价；河北省承德市样品质量较优；绿原酸（峰1）、牡荆素葡萄糖苷（峰3）和峰2、5对应成分可能是影响山楂叶药材质量的差异标志物。