艳山姜总黄酮改善无水乙醇致胃黏膜细胞损伤的作用及机制Δ

魏 晴，薛 娟，梁珊珊 （贵州中医药大学药学院，贵阳 550025）

艳山姜是姜科植物艳山姜Alpiniazerumbet（Pers.）Burtt.et Smith 的干燥根及根茎，是贵州特色苗药，能温中燥湿、行气止痛，可用于心腹冷痛、胸腹胀满、消化不良、呕吐腹泻等症[1]。本课题组前期研究结果表明，艳山姜可通过抑制氧化应激和炎症反应而减轻胃黏膜损伤，对无水乙醇和阿司匹林诱导的小鼠急性胃溃疡均有明显的改善作用[2]，但关于其药效物质基础和分子机制尚不明确。有研究指出，黄酮类成分是艳山姜中的主要成分，其中二氢-5，6-脱氢香豆素、5，6-脱氢卡因均具有抗实验性溃疡的作用，二氢-5，6-去氢醉椒素、5，6-去氢醉椒素均能拮抗实验性胃溃疡和十二指肠溃疡，山柰酚可通过调控白三烯C4和前列腺素E的表达而发挥抗溃疡作用[3―4]。由此推测，黄酮类成分可能是艳山姜抗溃疡的有效成分。

微RNA（microRNA，miRNA）是内源性的小非编码RNA（长度为17～25 个核苷酸），可通过直接与靶基因的3′-非翻译区（3′-untranslated region，3′-UTR）结合来负向调控该靶基因的表达，从而参与多种生理过程[5―6]。研究指出，miRNA-146a-5p（miR-146a-5p）过表达可降低核因子κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）蛋白及mRNA 的表达水平，同时还能减少炎症因子[肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）]的分泌，并可负向调控应激性胃溃疡的炎症反应，从而发挥抗胃溃疡作用[7]；进一步研究表明，miR-146a-5p 可通过预测靶蛋白肿瘤坏死因子受体关联因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）而进一步影响NF-κB 的下游通路，抑制人肝星状细胞中相关细胞因子的信号转导，对炎症反应具有重要的调节作用[8]。基于艳山姜的传统功效、miRNA的研究进展和本课题组的前期探索，本研究拟以人胃黏膜细胞为对象，以无水乙醇诱导建立急性胃溃疡模型，通过检测细胞中miR-146a-5p 与胃溃疡、炎症相关指标的表达/含量，探讨艳山姜总黄酮能否通过调控miR-146a-5p来发挥抗胃溃疡作用，为艳山姜及其活性成分的开发及利用提供实验基础。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括CFX96 型定量实时聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）仪、Trans-Blot TurboTM型Western转膜仪、DDY-10型电泳仪、Gel Doc XR 型凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad 公司），D180型CO2恒温培养箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），SMZ645 型光学显微镜（日本Nikon 公司），YTMB96A 全自动多功能酶标仪（山东云唐智能科技有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

艳山姜药材采自贵州省罗甸县，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为姜科植物艳山姜A.zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith的干燥根及根茎，标本存放于贵州中医药大学药学院产地加工与炮制实验室（标本号GY20221005001）。

兔源TRAF6、NF-κB p65、TNF-α、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（批号分别为CL647-66498、10745-1-AP、17590-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；过表达miR-146a-5p（miR-146a-5p mimic）及其阴性对照（mimic NC）、敲减miR-146a-5p（miR-146a-5p inhibitor）及其阴性对照（inhibitor NC）、敲减TRAF6（TRAF6 siRNA）及其阴性对照（NC siRNA）、含TRAF6野生型（TRAF6 WT）或突变型（TRAF6 MUT）的3′-UTR片段均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；腺病毒表达载体pacAd5 CMV-GFP（批号VECT10037）购自北京华越洋生物科技有限公司；荧光素酶pmirGLO载体（批号GN1439）购自上海盖宁生物科技有限公司；Lipofectamine 3000 转染试剂（批号MAN0009872）购自美国Sigma公司；正常兔IgG单克隆抗体（货号10010322-1）购自深圳艾美捷科技有限公司；RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒（批号分别为CW0581M、CW2569M）均购自康为世纪生物科技股份有限公司；IL-1β、IL-6、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（货号分别为A220819、A220815、A220806）均购自武汉华联科生物科技有限公司；MTT 试剂（货号SR0051）购自南京都莱生物技术有限公司；ECL 化学发光试剂盒（批号P0018S）购自上海碧云天生物技术有限公司；青-链霉素双抗、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化液、蛋白裂解液、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（批号D0010）均购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI-1640培养液、胎牛血清均购自美国HyClone公司。

1.3 细胞

人胃黏膜细胞GES-1（货号BFN60807461）购自美国ATCC细胞库。

2 方法

2.1 艳山姜总黄酮的制备

取艳山姜药材，粉碎，取粗粉100 g，用95%乙醇1 000 mL加热回流提取2 h×3次；合并提取液，过滤，浓缩，制得浸膏（浸膏得率18.69%）。取上述浸膏，用适量水溶解，再加入适量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，制得总黄酮浸膏[总黄酮浸膏得率2.28%，纯度42.61%（以芦丁计）]，再用水溶解，制成质量浓度为30 mg/mL（按生药量计）的艳山姜总黄酮溶液，备用。

2.2 艳山姜总黄酮对细胞活力影响的考察及作用浓度的筛选

2.2.1 对细胞活力影响的考察

将正常GES-1 细胞接种于96 孔板中并分为空白组和艳山姜总黄酮不同质量浓度组（24、48、60、80、120 mg/L，质量浓度按前期预实验结果设置），每组设6个复孔。空白组加入RPMI-1640 培养液（含青-链霉素双抗和10%胎牛血清）20 μL，其余各组分别加入含不同质量浓度艳山姜总黄酮的RPMI-1640 培养液20 μL；培养24 h 后，每孔加入MTT 溶液20 μL[9]；孵育4 h 后，吸弃培养液，加入二甲基亚砜150 μL，振荡15 min后，使用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值并按下式计算各组细胞活力：细胞活力＝实验组OD 值/空白组OD值×100%。

2.2.2 作用浓度的筛选

将正常GES-1细胞接种于96孔板中并分为空白组、模型组和模型+艳山姜总黄酮不同质量浓度组（24、48、60、80、120 mg/L，质量浓度按前期预实验结果设置），每组设6个复孔。空白组和模型组加入RPMI-1640培养液（含青-链霉素双抗和10%胎牛血清）20 μL；各药物组加入含不同质量浓度艳山姜总黄酮的RPMI-1640 培养液20 μL；培养12 h后，模型组和各药物组分别加入无水乙醇7 μL以建立急性胃溃疡细胞模型，空白组加入RPMI-1640 培养液（含青-链霉素双抗和10%胎牛血清）7 μL；培养12 h 后，每孔加入MTT 溶液20 μL，按“2.2.1”项下方法检测各组细胞活力，以确定后续实验中艳山姜总黄酮的最适作用浓度。

2.3 细胞中miR-146a-5p表达水平的检测

采用qRT-PCR 法进行检测。将正常GES-1 细胞接种于96孔板中并分为空白组、模型组和模型+艳山姜总黄酮组（质量浓度按“2.2.2”项下结果设置），每组设6 个复孔。按“2.2.2”项下方法培养、处理后，收集各组细胞，提取总RNA 并使用逆转录试剂盒处理得到cDNA。以所得cDNA 为模板，进行PCR 扩增。反应体系（20 μL）包括：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，水8 μL，2×Mix 10 μL。miR-146a-5p的上游引物为5′-AGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游引物为5′-GACAGAGATATCCCAGCTGAAGAA-3′，产物长度为397 bp；U6的上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，产物长度为94 bp。反应条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35 个循环；72 ℃再延伸5 min。以U6 为内参，使用2－ΔΔCt法计算miR-146a-5p 的相对表达量，结果以空白组为参照进行归一化处理。

2.4 细胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α 蛋白表达水平的检测

采用Western blot法进行检测。收集“2.3”项下空白组、模型组、模型+艳山姜总黄酮组细胞，以RIPA裂解液裂解、提取细胞中的总蛋白，以BCA 法测定蛋白浓度后，于100 ℃下加热5 min 变性；取变性蛋白适量，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入GAPDH、NF-κB p65、TRAF6、TNF-α一抗（稀释比例分别为1∶20 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000），于4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例为1∶1 000），于室温下孵育1 h；用ECL 试剂显影后，使用凝胶成像仪检测并使用Image-Pro Plus 6软件进行分析，以目的蛋白灰度值与内参蛋白（GAPDH）灰度值的比值作为目的蛋白的表达水平，结果以空白组为参照进行归一化处理。

2.5 细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的检测

采用ELISA 法进行检测。收集“2.3”项下空白组、模型组、模型+艳山姜总黄酮组细胞上清液，参照相应试剂盒说明书方法，使用酶标仪检测各组细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平。

2.6 miR-146a-5p与TRAF6靶向关系的验证

2.6.1 双荧光素酶报告基因实验

本课题组前期采用Targetscan 预测软件，设置物种为“human”，依据“context score”进行miR-146a-5p 靶点筛选（评分越低则靶向的可能性越大），结果显示，miR-146a-5p能够与TRAF6的3′-UTR结合，提示两者存在靶向关系。为进一步确认两者关系，本研究采用双荧光素酶报告基因实验进行验证：将含有预测结合位点TRAF6 WT 或TRAF6 MUT 的3′-UTR 片段分别克隆于荧光素酶pmirGLO 载体上，经DNA 测序验证后，利用Lipofectamine 3000 转染试剂分别将TRAF6 WT 和miR-146a-5p mimic、TRAF6 WT 和mimic NC、TRAF6 MUT和miR-146a-5p mimic、TRAF6 MUT 和mimic NC 共转染至正常GES-1细胞中（每组设3个复孔）；24 h后取出，使用多功能酶标仪检测各组细胞的荧光素酶活性。

2.6.2 RNA结合蛋白免疫沉淀实验

将正常GES-1细胞接种于6孔板中并分为不加抗体的input组（作背景参考）、与正常兔IgG抗体共孵育的阴性对照组和与TRAF6 抗体共孵育的anti-TRAF6 组，每组设3个复孔。收集细胞，使用RNA结合蛋白免疫沉淀裂解缓冲液裂解；取裂解物100 μL，与含磁珠的缓冲液混合后，与正常兔IgG 抗体或TRAF6 抗体（稀释比例均为1∶200）一起孵育；蛋白经蛋白酶K 缓冲液消化后，使用Trizol 试剂盒分离上述抗体结合的RNA，采用qRTPCR 法测定miR-146a-5p 的表达水平（具体操作和结果处理同“2.3”项）。若TRAF6抗体结合的miR-146a-5p的表达高于阴性对照，则说明miR-146a-5p 与TRAF6 有特异性结合。

2.6.3 Western blot实验

将正常GES-1 细胞接种于6 孔板中并分为mimic NC 组、miR-146a-5p mimic 组、inhibitor NC 组和miR-146a-5p inhibitor 组，每组设6 个复孔。利用Lipofectamine 3000 转染试剂分别转染mimic NC、miR-146a-5p mimic、inhibitor NC、miR-146a-5p inhibitor；24 h后，收集各组细胞，采用Western blot 法检测TRAF6 蛋白的表达水平（具体操作和结果处理同“2.4”项）。

2.7 过表达miR-146a-5p或敲减TRAF6对模型细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2影响的检测

为进一步确认miR-146a-5p 能否通过TRAF6 调控胃溃疡的发生，本研究借助过表达miR-146a-5p 或敲减靶点TRAF6 蛋白的方式，观察急性胃溃疡模型细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2的变化情况。取正常GES-1细胞，消化后接种于6 孔板中，培养24 h；将细胞分为模型组、模型+mimic NC 组、模型+miR-146a-5p mimic 组（过表达miR-146a-5p 实验），以及空白组、空白+NC siRNA组、空白+TRAF6 siRNA 组和模型组、模型+NC siRNA组、模型+TRAF6 siRNA组（敲减TRAF6实验），每组设6个复孔。除模型组/空白组外，其余各组分别利用Lipofectamine 3000 转染试剂转染mimic NC、miR-146a-5p mimic、NC siRNA、TRAF6 siRNA；24 h 后，除空白组、空白+NC siRNA 组、空白+TRAF6 siRNA 组外的其余各组细胞均加入无水乙醇70 μL 以建立急性胃溃疡细胞模型。培养12 h后，收集各组细胞，采用Western blot法检测各组细胞中TRAF6 蛋白的表达水平（空白组、空白+NC siRNA 组、空白+TRAF6 siRNA 组，具体操作和结果处理同“2.4”项）以验证TRAF6 的敲减情况。再采用ELISA 法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平（模型组、模型+mimic NC组、模型+miR-146a-5p mimic组和模型组、模型+NC siRNA 组、模型+TRAF6 siRNA 组，具体操作同“2.5”项）。

2.8 敲减miR-146a-5p 对艳山姜总黄酮抗胃溃疡作用的影响

本研究进一步通过敲减miR-146a-5p 的方式，观察转染miR-146a-5p inhibitor 能否逆转艳山姜总黄酮对无水乙醇致胃黏膜细胞损伤的改善作用。取正常GES-1细胞，消化后接种于6 孔板中，培养24 h；将细胞分为模型+艳山姜总黄酮组、模型+艳山姜总黄酮+inhibitor NC组、模型+艳山姜总黄酮+miR-146a-5p inhibitor 组，每组设6 个复孔。除模型+艳山姜总黄酮组外，其余各组分别利用Lipofectamine 3000转染试剂转染inhibitor NC和miR-146a-5p inhibitor；24 h 后，各组细胞均用含艳山姜总黄酮（质量浓度按“2.2.2”项下结果设置）的RPMI-1640 培养液200 μL；培养12 h 后，各组细胞均加入无水乙醇70 μL以建立急性胃溃疡细胞模型。培养12 h后，收集各组细胞，采用Western blot 法检测各组细胞中TRAF6 蛋白的表达水平（具体操作和结果处理同“2.4”项），采用ELISA法检测细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平（具体操作同“2.5”项）。

2.9 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件和GraphPad Prism 8 软件对数据进行统计分析。所有数据均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 艳山姜总黄酮对细胞活力的影响及作用浓度筛选结果

随着艳山姜总黄酮质量浓度的升高，各药物组细胞活力均较空白组逐渐降低，但组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05），详见图1A。与空白组比较，模型组细胞活力显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，模型+艳山姜总黄酮48、60、80、120 mg/L组细胞活力均显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），详见图1B。因此，选取对细胞无明显毒性但能改善无水乙醇所致损伤的60 mg/L作为后续实验艳山姜总黄酮的作用浓度。

图1 艳山姜总黄酮对细胞活力的影响及作用浓度筛选的结果（±s，n＝6）

3.2 艳山姜总黄酮对模型细胞中miR-146a-5p、炎症相关蛋白表达和上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响

与空白组比较，模型组细胞中miR-146a-5p 的相对表达量和上清液中PGE2水平均显著降低（P＜0.01），细胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表达水平和上清液中IL-1β、IL-6水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，模型+艳山姜总黄酮组细胞中miR-146a-5p的相对表达量和上清液中PGE2水平均显著升高（P＜0.01），细胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表达水平和上清液中IL-1β、IL-6 水平均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。结果见图2、表1。

表1 艳山姜总黄酮对模型细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响（±s，n＝6）

表1 艳山姜总黄酮对模型细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响（±s，n＝6）

a：与空白组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01。

组别空白组模型组模型+艳山姜总黄酮组IL-1β/（ng/mL）3.17±0.12 18.32±1.13a 8.25±0.32b IL-6/（ng/mL）5.95±0.35 18.11±1.22a 8.68±0.92b PGE2/（ng/mL）6.86±0.38 3.14±0.19a 4.53±0.23b

图2 艳山姜总黄酮对模型细胞中miR-146a-5p 和NFκB p65、TRAF6、TNF-α 蛋白表达的影响（±s，n＝6）

3.3 miR-146a-5p与TRAF6靶向关系的验证结果

双荧光素酶报告基因实验结果（图3A）显示，转染TRAF6 WT 后，共转染miR-146a-5p mimic 细胞的荧光素酶活性显著低于共转染mimic NC 细胞（P＜0.01）；而转染TRAF6 MUT后，共转染miR-146a-5p mimic细胞的荧光素酶活性与共转染mimic NC 细胞比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。RNA结合蛋白免疫沉淀实验结果（图3B）显示，与阴性对照比较，miR-146a-5p 在TRAF6抗体上的表达显著升高（P＜0.01）。进一步的Western blot 实验结果（图3C、3D）显示，与mimic NC 组比较，转染miR-146a-5p mimic 后，细胞中TRAF6 蛋白的表达水平显著降低（P＜0.01）；与inhibitor NC 组比较，转染miR-146a-5p inhibitor 后，细胞中TRAF6 蛋白的表达水平显著升高（P＜0.01）。

图3 miR-146a-5p与TRAF6靶向关系的验证结果

3.4 过表达miR-146a-5p或敲减TRAF6对模型细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响

3.4.1 过表达miR-146a-5p实验

与模型组或模型+mimic NC 组比较，模型+miR-146a-5p mimic 组细胞上清液中IL-1β、IL-6 水平均显著降低（P＜0.05），PGE2水平显著升高（P＜0.05），结果见表2。

表2 过表达miR-146a-5p对模型细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响（±s，n＝6）

表2 过表达miR-146a-5p对模型细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响（±s，n＝6）

a：与模型组比较，P＜0.05；b：与模型+mimic NC组比较，P＜0.05。

组别模型组模型+mimic NC组模型+miR-146a-5p mimic组PGE2/（ng/mL）5.92±0.28 5.74±0.27 6.93±0.32ab IL-1β/（ng/mL）3.20±0.12 3.02±0.11 2.17±0.09ab IL-6/（ng/mL）6.03±0.38 5.89±0.32 4.64±0.18ab

3.4.2 敲减TRAF6实验

转染TRAF6 siRNA 后，细胞中TRAF6 蛋白的表达水平显著低于空白组细胞和转染NC siRNA的细胞（P＜0.05），表明敲减TRAF6蛋白的GES-1细胞构建成功（图4）。与模型组或模型+NC siRNA 组比较，模型+TRAF6 siRNA 组细胞上清液中IL-1β、IL-6 水平均显著降低（P＜0.05），PGE2水平显著升高（P＜0.05），说明TRAF6蛋白能够激活下游通路，刺激无水乙醇诱导的GES-1细胞分泌炎症因子（表3）。

表3 敲减TRAF6 对细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响（±s，n＝6）

表3 敲减TRAF6 对细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响（±s，n＝6）

a：与模型组比较，P＜0.05；b：与模型+NC siRNA组比较，P＜0.05。

组别模型组模型+NC siRNA组模型+TRAF6 siRNA组PGE2/（ng/mL）5.86±0.28 5.80±0.27 6.84±0.29ab IL-1β/（ng/mL）3.17±0.12 3.14±0.11 2.05±0.08ab IL-6/（ng/mL）5.95±0.35 5.91±0.34 3.17±0.17ab

3.5 敲减miR-146a-5p对模型细胞中TRAF6蛋白表达及上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响

与模型+艳山姜总黄酮组或模型+艳山姜总黄酮+inhibitor NC组比较，模型+艳山姜总黄酮+miR-146a-5p inhibitor组细胞中TRAF6蛋白的表达水平和上清液中IL-1β、IL-6水平均显著升高（P＜0.05），PGE2水平显著降低（P＜0.05）。结果见图5、表4。

表4 敲减miR-146a-5p 对模型细胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影响（±s，n＝6）

a：与模型+艳山姜总黄酮组比较，P＜0.05；b：与模型+艳山姜总黄酮+inhibitor NC组比较，P＜0.05。

PGE2/（ng/mL）6.28±0.34 5.89±0.30 3.47±0.19ab组别模型+艳山姜总黄酮组模型+艳山姜总黄酮+inhibitor NC组模型+艳山姜总黄酮+miR-146a-5p inhibitor组IL-1β/（ng/mL）2.28±0.09 2.31±0.10 3.68±0.28ab IL-6/（ng/mL）5.01±0.29 4.89±0.27 6.24±0.38ab

图5 敲减miR-146a-5p 对模型细胞中TRAF6 蛋白表达的影响

4 讨论

作为贵州特色苗药，艳山姜常被用于治疗胃溃疡。现代研究表明，黄酮类成分是艳山姜的主要成分，包括芦丁、槲皮素和山柰酚等；同时，黄酮类成分也是艳山姜的药效成分，具有降压、利尿和抗溃疡的活性[10]。因此，本研究以艳山姜总黄酮为干预成分，以人GES-1细胞为对象，评价艳山姜总黄酮对无水乙醇致急性胃溃疡模型细胞的改善作用。结果表明，艳山姜总黄酮能通过抑制细胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表达和下游炎症因子IL-1β、IL-6的分泌，从而发挥对胃黏膜细胞损伤的改善作用。

miRNA由内源基因编码，对多种生物学行为具有重要的调节作用，可广泛参与多种基因表达和RNA 沉默的调控[11―12]。综合既往文献和现代研究进展，本研究选择了与胃溃疡相关的miR-146a-5p进行研究，结果表明，在无水乙醇诱导的急性胃溃疡模型细胞中，miR-146a-5p 的相对表达量显著降低，而模型+艳山姜总黄酮组细胞中miR-146a-5p的相对表达量显著升高。

为进一步探索miR-146a-5p 对胃溃疡的调控作用，本研究通过qRT-PCR、Western blot、细胞转染等实验对miR-146a-5p的靶点和调控机制进行了探讨。双荧光素酶报告基因、RNA 结合蛋白免疫沉淀实验和针对TRAF6 蛋白的Western blot 实验结果均证实了miR-146a-5p与TRAF6蛋白之间存在靶向关系，且miR-146a-5p能够负向调控TRAF6蛋白的表达。本研究经进一步过表达miR-146a-5p 或敲减TRAF6 后发现，无水乙醇致急性胃溃疡模型细胞上清液中与炎症相关的IL-1β 和IL-6水平均显著降低，而与胃溃疡相关的PGE2水平显著升高，说明过表达miR-146a-5p 或敲减TRAF6 均能抑制下游炎症因子的释放，从而发挥抗胃溃疡作用。

为进一步探索TRAF6 对下游通路的影响，本研究通过Western blot法对TRAF6下游的NF-κB p65和TNFα蛋白表达情况进行检测，结果显示，在无水乙醇诱导的急性胃溃疡模型细胞中，艳山姜总黄酮能显著提高上述蛋白的表达。TRAF6、NF-κB p65、TNF-α均为NF-κB信号通路上的关键蛋白，而NF-κB通路能够调控胃黏膜上皮细胞炎症反应的发生[13―15]。研究指出，在生长因子等活性物质的刺激下，胃溃疡患者的胃黏膜上皮细胞通透性增加，可使有毒物质和病原微生物穿过胃壁，从而激活TRAF6；TRAF6 可进一步激活下游核因子κB 抑制因子B（inhibitory subunit of NF-κB，IкB），使细胞质中原本与IкB蛋白相结合的NF-кB从复合体中释放出来，并迁移到细胞核中；细胞核中的NF-кB可触发其他促炎细胞因子（如IL-1β 和TNF-α）的转录和释放，从而促进溃疡的发展[16―18]。本研究结果还表明，艳山姜总黄酮可上调无水乙醇致急性胃溃疡模型细胞中miR-146a-5p 的表达；敲减miR-146a-5p 可逆转艳山姜总黄酮对急性胃溃疡模型细胞的改善作用，增加IL-1β、IL-6 的分泌，提示艳山姜总黄酮可通过上调miR-146a-5p 而抑制TRAF6的表达，进一步抑制下游炎症因子的分泌，从而发挥抗胃溃疡作用。

综上所述，艳山姜总黄酮对无水乙醇致胃黏膜细胞损伤有一定的改善作用，其机制可能与上调miR-146a-5p的表达、抑制TRAF6蛋白的表达，进而抑制相关炎症因子的分泌有关。本研究结果为艳山姜总黄酮促进miR-146a-5p 表达、参与调控胃溃疡的研究提供了新的证据，对进一步挖掘胃溃疡的治疗方法具有重要意义。