基于HPLC 指纹图谱、多指标定量检测及化学计量学的痢泻灵片质量评价

★ 苏星 陈剑平 胡娇娇 黄静萍 黄恩堂（.鹰潭市综合检验检测中心 江西 鹰潭 335000；.江西省药品检查员中心 南昌 33009）

痢泻灵片是由拳参、穿心莲、苦参3 味中药组成的中成药，具有清热解毒、止痢、止泻的功效，用于热泻、湿热痢疾等症［1］。痢泻灵片现收载于国家卫生部药品标准《中药成方制剂》（第二册），仅有检查项目，无专属鉴别检查和含量测定方法。近些年对痢泻灵片的检验方法研究较少，文献也并不多见。现行的痢泻灵片文献报道多针对其中的1~2 种成分进行含量测定研究［2-5］，而中成药复方制剂具有多成分、多靶点，成分间相互协调、相互制约，整体作用等特点，现有的单成分质量控制方法难以全面反映其整体质量。

中药指纹图谱是目前综合评价中药及其制剂的常用方法，具有整体性好、信息量大、特征性强等特点［6］，结合聚类分析、主成分分析等化学计量学分析方法可为中药、特别是中成药复方制剂的质量评价提供更多的、更多维的信息。

本研究首次将中药指纹图谱技术与HPLC 法定量测定及化学计量学分析法相结合，用于痢泻灵片的质量控制，通过中药指纹图谱相似度评价软件对不同厂家不同批次的痢泻灵片指纹图谱相似度进行评价，同时采用聚类分析和主成分分析法对10 批痢泻灵片的质量进行分析。在此基础上建立了一个同时测定痢泻灵片中苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量测定方法，为更好地对痢泻灵片质量进行监管和控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（四元泵，UV检测器，美国Agilent 公司）；MSE125P-1CE-DU型电子天平（精度0.01 mg，赛多利斯科学仪器〈北京〉有限公司）；MSE224S-1CE-DU 型电子天平（精度0.1 mg，赛多利斯科学仪器〈北京〉有限公司）；KQ-500DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。对照品：苦参碱（批号：110805-201709，质量分数为98.7%）、氧化苦参碱（批号：110780-201508，质量分数为92.5%）、穿心莲内酯（批号：110797-201609，质量分数为99.7%）、脱水穿心莲内酯（批号：110854-201710，质量分数为99.4%）。对照药材：苦参（批号：121019-201708）、穿心莲（批号：121082-201706）、拳参（批号：121569-201602）。对照品及对照药材均购自中国食品药品检定研究院，10 批痢泻灵片均购自市场。见表1。

表1 10批痢泻灵片的具体信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）；以乙腈-0.01 mol/L 乙酸铵溶液（浓氨试液调pH 8.1）（3∶2）为流动相A，0.01 mol/L醋酸铵溶液（用氨试液调pH 8.1）为流动相B，梯度洗脱（0~10 min，5%~10%A；10~30 min，10%~25%A；30~45 min，25%~40%A；45~70 min，40%~50%A；70~80 min，50%~55%A；80~90 min，55%~60%A；90~95 min，60%~5%A）；流速为1.0 mL/min；检测波长为225 nm；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。在该条件下，混合对照品溶液及痢泻灵片样品溶液的HPLC 色谱图见图1。

图1 典型液相色谱图

2.2 混合对照品溶液的制备

取苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量，加甲醇溶解并稀释成浓度分别为0.098 5、0.076 7、0.018 4、0.020 2 mg/mL 的对照品混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品20 片，除去包衣，研成细粉，精密称取2.400 g，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷50 mL及氨水1 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，加在中性氧化铝柱（200~300 目，8 g，内径15 mm）上，用15 mL 三氯甲烷洗脱后，继续用三氯甲烷-甲醇（3∶7）15 mL 洗脱，合并洗脱液，挥去溶剂，残渣用甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 苦参和穿心莲阴性样品的制备

按处方比例分别配制苦参和穿心莲阴性样品，照“2.3”项下的供试品制备方法进行处理，即得苦参和穿心莲阴性样品。

2.5 单味药材供试品溶液的制备

取苦参、穿心莲、拳参粉末各2.4 g，按照“2.3”项下的供试品制备方法进行处理，即得各单味药材供试品溶液。

2.6 指纹图谱研究

2.6.1 精密度试验 取同一痢泻灵片供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图，以9 号穿心莲内酯色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD值在0.11%~4.76%之间，相对峰面积RSD值在1.30%~3.06%之间，均＜5%，表明仪器精密度良好。

2.6.2 重复性试验 取痢泻灵片适量，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图，以9 号穿心莲内酯色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD值在0.18%~4.58%之间，相对峰面积RSD值在0.44%~1.05%之间，表明该方法的重复性良好。

2.6.3 稳定性试验 取同一痢泻灵片供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，记录色谱图，以9 号穿心莲内酯色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD值在0.40%~4.68%之间，相对峰面积RSD值在1.13%~3.67%之间，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.4 指纹图谱的建立 取10 批痢泻灵片样品溶液，进样测定，将数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以1 号样品色谱图为参照图谱，采用平均数法，经全谱峰匹配，生成对照图谱（R），10 批痢泻灵片指纹图谱与对照图谱的相似度分别为0.996、0.996、0.963、0.921、0.996、0.996、0.997、0.997、0.997、0.997，符合指纹图谱研究要求。见图2。

图2 10批痢泻灵片HPLC指纹图谱（S1～S10）和对照指纹图谱（R）

取单味药材溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图3。结合前述苦参与穿心莲阴性样品的色谱图，对痢泻灵片样品溶液色谱图中的峰进行归属，共确定了13 个共有峰，其中1~8 来自苦参，9~12 来自穿心莲，13 号峰未进行归属。

图3 单味药材溶液的HPLC色谱图

2.6.5 聚类分析 将10 批痢泻灵片的共有峰峰面积导入SPSS 25.0 软件进行聚类分析［6-7］，采用系统聚类法，10 批痢泻灵片可以分为3 类，S4、S5、S6、S7为第1 类，S3、S8、S9、S10为第2 类，S1和S2为第3 类，这与表1 中10 批样品的生产厂家来源相符，说明相同厂家生产的痢泻灵片的质量稳定，而不同生产厂家不同批次痢泻灵片的质量存在差异，这可能与厂家所用中药材的产地、采收时间、加工、运输、存储有关。见图4。

图4 10批痢泻灵片的聚类分析图

2.6.6 主成分分析 采用 SPSS 25.0 统计分析软件将10 批痢泻灵片13 个共有峰的峰面积做标准化处理后，以主成分的特征值和贡献率为依据，对其进行主成分分析［7］。为使分析结果更加直观，主成分分析选取3个主成分，特征值分别为7.141、4.465、1.159，累积方差贡献率分别是54.929%、89.272%、98.184%。见表2。

表2 特征值和方差贡献率

10 批痢泻灵片根据主成分得分Z1、Z2、Z3作散点图分析其聚类结果。主成分分析聚类结果见图5，在主成分空间中距离较近的为同类样本，距离较远的为不同类样本。结果表明10 批痢泻灵片中，S4~S7聚在一起为一类，S8、S9、和S10距离极近，归为一类，S3距离S8~S10更近，S1和S2距离其他样本均较远，此结果与聚类分析结果较一致。

图5 10批痢泻灵片主成分分析散点图

2.7 4 种组分的含量测定

2.7.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液适量，按“2.1”项下的色谱条件依次进样2、5、10、15、20、25 μL，记录色谱峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所测的4 种成分在各自的进样量范围内与峰面积的线性关系良好。见表3。

表3 痢泻灵片中4种成分的线性关系

2.7.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图，计算得到苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰面积的RSD值分别为0.53%、0.92%、0.36%、0.53%，表明仪器的精密度良好。

2.7.3 重复性试验 取痢泻灵片适量，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，计算得到上述4 种成分含量，RSD值分别为2.65%、2.14%、2.32%和2.33%，表明该方法重复性良好。

2.7.4 稳定性试验 取痢泻灵片供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样测定，记录色谱图，计算得到上述4种成分峰面积RSD分别为0.99%、1.71%、0.64%、0.68%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7.5 加标回收率试验 称取已知含量的样品6 份（1 号样品，含量为含苦参碱0.287 mg/g，含氧化苦参碱0.129 mg/g，穿心莲内酯0.125 mg/g，脱水穿心莲内酯0.012 mg/g），每份1.200 g（供试品称样量的1/2），分别精密加入适量浓度的混合对照品溶液（含0.387 7 mg/mL 苦参碱，0.178 7 mg/mL 氧化苦参碱，0.183 4 mg/mL 穿心莲内酯和0.013 1 mg/mL 脱水穿心莲内酯）1 mL，按供试品溶液的制备方法操作，并按“2.1”项下的色谱条件进样，记录色谱图，计算回收率，苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的平均回收率分别为104.7%、96.1%、108.2%、92.2%，RSD分别为2.76%、2.27%、3.25%和1.97%，符合《中国药典》要求，表明该方法准确性良好。见表4。

表4 4种成分加标回收率试验结果

2.7.6 样品测定 精密称取痢泻灵片粉末，按“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量。见表5。

表5 痢泻灵片中4种成分的含量测定结果 μg/g

3 讨论

3.1 检测波长的选择

查阅文献［2-4］，并进行预实验显示，痢泻灵片中苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的最大吸收波长在219、339、224、249、214 nm，通过比较各波长下的色谱图发现，检测波长为225 nm 时，痢泻灵片色谱图中色谱峰最多，分离度也适合，并且各特征峰的峰型较好，故而在进行指纹图谱研究时选择225 nm 为检测波长。

3.2 色谱条件的选择

前期查阅文献，2015 年版《中国药典》一部中苦参的含量测定采用的是氨基柱，而2020 年版《中国药典》一部采用的是C18柱梯度洗脱，尝试药典的两种方法以及一些文献方法［2-5］，结果发现采用氨基柱的方法重现性差，而C18柱梯度洗脱法的结果重现性较好，结果较为稳定，根据峰分离情况，选择C18柱及梯度洗脱的方法。

3.3 供试品制备方法的选择

分别对提取溶剂（甲醇、乙醇或三氯甲烷）、提取方法（加热回流或超声）和最后中性氧化铝柱的洗脱溶剂（不同比例甲醇和三氯甲烷混合溶液）进行考察，比较4 个待测组分的峰面积，最终选定“2.3”项下的样品制备方法。

3.4 指纹图谱及含量测定

本研究建立了痢泻灵片的HPLC 指纹图谱，共发现13 个共有峰，与对照品进行比对，指认出其中的4 个，10 批痢泻灵片与对照图谱之间的相似度均高于0.9，所建立的指纹图谱方法稳定可靠。10 批痢泻灵片的含量测定结果存在较大的差异，苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量分别是77.5~302.8 μg/g、4.0~171.7 μg/g、86.0~160.7 μg/g、2.9~40.3 μg/g。从结果来看，不同样品间4 种成分的含量差别较大，其中样品3 的氧化苦参碱含量极低，样品8~10 的脱水穿心莲内酯含量也极低，提示不同厂家生产中投料的药材质量参差不齐，该品种的质量需要得到更为严格的控制。

综上，本研究所建立的用于控制痢泻灵片质量的HPLC 指纹图谱和含量测定方法稳定可靠，可为其质量控制提供科学依据。