基于网络药理学探究枸杞子-菊花药对治疗糖尿病视网膜病变的作用机制

徐希,齐月

辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110847

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)指由糖尿病(diabetes mellitus,DM)引起的高度特异性神经血管并发症,是糖尿病最常见的并发症之一[1],也是工作年龄人群视力丧失的主要原因[2]。据国际糖尿病联盟估计,全球糖尿病视网膜病变的患病人数将从2020年的1.03亿增加到2045年的1.6亿[3],而中国和印度等发展中国家的情况将更加严峻,超过三分之一的糖尿病患者表现出不可逆的失明迹象[4]。除了对视力的损伤之外,糖尿病视网膜病变的存在还意味着威胁生命的全身血管并发症风险增加,包括肾脏、心脏、神经等[5]。

临床上将DR分为两个阶段,非增殖期糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增殖期糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)。NPDR阶段常常以微血管动脉瘤、出血、硬性渗出为主要病理改变,但是患者通常不会表现出明显的临床症状。随着病情进展,PDR阶段以新生血管形成为主要病理改变,出现玻璃体出血及牵拉性视网膜脱落等严重损害患者视力的临床表现[6],其发病机制尚不明确,可能与代谢紊乱、氧化应激、炎症反应、遗传免疫等因素导致视网膜的神经血管结构及功能损伤相关[7]。目前,DR主要采用激光光凝、玻璃体内注射血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)药物、激素治疗及手术治疗。虽然上述疗法在一定程度上可改善患者视力,但存在不良反应多、治疗费用高、患者依从性差等问题[8]。因此,为DR患者选择合适有效的治疗方法成为临床亟待解决的问题。

糖尿病视网膜病变属中医学“消渴内障”“视瞻昏渺”“暴盲”等范畴,其病机多以消渴病阴虚燥热为先,病变日久损及肝肾,肝肾之阴亏虚,不能上荣于目所致[9]。枸杞子-菊花药对具有滋补肝肾、益精明目的功效,广泛应用于中医眼科治疗糖尿病视网膜病变,其中杞菊地黄丸为中医眼科经典成药[10]。同时现代药理学也证实,枸杞子-菊花药对可以通过抗炎、抗氧化治疗DR[11]。因此,本研究基于网络药理学技术,以系统生物学思想为基础,“一药多靶”和“多成分多靶点”为研究思路构建药物-靶点-疾病网络图,与中医学“整体观念”与“辨证论治”的指导思想相契合,多维度立体化探究枸杞子-菊花药对治疗DR的作用机制。

1 资料与方法

1.1 枸杞子-菊花药对活性成分及相关靶点的获取利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索枸杞子、菊花的化学成分,根据药代动力学参数(absorption、distribution、metabolism、excretion,ADEM)设置口服生物利用度(oral bioavail-ability,OB)≥30%及类药性(drug-likeness,DL)≥0.18筛选出枸杞子、菊花的活性成分。通过TCMSP数据库预测枸杞子、菊花活性成分相关靶点,同时删去未检索出相关靶点的活性成分。利用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)将所获靶点标准化并获得基因名。利用Cytoscape3.9.1绘制“药对-活性成分-作用靶点”网络图,并进行拓扑分析筛选枸杞子-菊花药对治疗DR的主要活性成分。

1.2 DR相关靶点的搜集及枸杞子-菊花药对治疗DR的潜在靶点的获取将检索词设置为“Diabetic Retionpathy”,利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)及药物靶标数据库(therapeutic target database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)检索并获得DR相关靶点,整合所有疾病数据库DR相关的靶基因并删除重复项,建立疾病靶点数据库。将筛选出的活性成分相关靶点与疾病靶点导入Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线平台,绘制韦恩图,交集靶点即为枸杞子-菊花药对治疗DR的潜在靶点。

1.3 蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络的构建将枸杞子-菊花药对治疗DR的潜在靶点上传至STRING数据库(https://cn.string-db.org/,Version 11.5),物种限定为“Homo sapiens”,设置最低要求互作分数0.4并隐藏游离靶点,构建PPI网络关系,并下载“tsv”格式表格,导入Cytoscape 3.9.1软件中绘制PPI网络,使用“Tools”工具下的“Network Analysis”对PPI网络进行拓扑分析,依据分析结果中的度值(Degree),调节节点的位置及大小。根据CytoNCA插件筛选出中介中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、度中心性(degree centrality,DC)三者均大于中位数值的靶点,并取这些靶点中Degree值排名前30位的靶点为枸杞子-菊花药对治疗DR的核心靶点。

1.4 富集分析将枸杞子-菊花药对治疗DR的核心靶点输入Metascape在线平台(http://metascape.org)进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析。Species选择H.sapiens,设置最小交叠数为3,P<0.01,最小富集数为1.5,预测核心靶点参与调控的生物学过程及相关信号通路。通过在线绘图软件绘制柱状图及气泡图将部分GO富集结果及排名前20位的KEGG通路富集结果可视化。将活性成分、核心靶点、信号通路导入Cytoscape 3.9.1软件构建“活性成分-作用靶点-信号通路-DR”网络图。

2 结果

2.1 枸杞子-菊花药对活性成分及靶点利用TCMSP数据库检索枸杞子、菊花的所有化学成分,以OB≥30%及DL≥0.18为限定条件,筛选出枸杞子、菊花的活性成分65种,共同成分有槲皮素、β-谷甾醇2种。通过TCMSP数据库预测枸杞子、菊花活性成分相关靶点,合并去重并删除未检索出相关靶点的活性成分后,共获得活性成分52种。部分活性成分信息见表1。通过TCMSP预测52种活性成分相关靶点,合并并删除重复及假阳性后,获得活性成分相关靶点247个。将活性成分及靶点数据导入Cytoscape 3.9.1软件构建 “药对-活性成分-作用靶点” 可视化网络图,该网络共有317个节点和907条边,其中浅粉色节点代表枸杞子活性成分,绿色节点代表菊花活性成分,橙色及深粉色节点代表两者相同活性成分,黄色节点代表活性成分相应靶点。对该网络进行拓扑分析后,筛选出度值排名前10位的活性成分,分别为槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)、异鼠李亭(isorhamnetin,)、豆甾醇(Stigmasterol)、阿托品(Atropine)、金合欢素(acacetin)、黄豆黄素(glycitein),提示上述活性成分为枸杞子-菊花药对治疗DR的主要活性成分。见图1。

图1 “药对-活性成分-作用靶点”网络图

表1 枸杞子-菊花部分活性成分信息表

2.2 DR相关靶点将检索词设置为“Diabetic Retionpathy”,通过GeneCards、OMIM及TTD数据库分别检索得到DR相关靶点2 165个、229个、30个,合并并删除重复项后共获得疾病靶点2 347个。将247个活性成分相关靶点与2 347个疾病靶点导入Venny 2.1在线平台,绘制韦恩图,得到133个交集靶点,即为枸杞子-菊花药对治疗DR的潜在靶点。见图2。

图2 枸杞子-菊花药对活性成分靶点与DR靶点韦恩图

2.3 PPI网络将枸杞子-菊花药对治疗DR的潜在靶点上传至STRING数据库,物种限定为“Homo sapiens”,设置最低要求互作分数0.4并隐藏游离靶点,构建PPI网络关系,下载“tsv”格式表格并导入Cytoscape 3.9.1软件,构建PPI网络,该网络共有133个节点,269条边,平均度值为40.4。网络图中节点越大、颜色越深代表该节点的Degree值越大。利用Cytoscape 3.9.1中CytoNCA插件筛选出网络中节点DC、CC、BC值均大于中位数的靶点,取这些靶点中Degree值排名前30位的靶点为枸杞子-菊花药对治疗DR的核心靶点,其中包括蛋白激酶Bα(protein kinase Bα,AKT1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤抗原P53(tumor antigen p53,TP53)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3,CASP3)、丝裂原激活蛋白激酶3(mitogen activated protein kinase 3,MAPK3)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等。见图3、图4及表2。

图3 潜在靶点PPI网络图

图4 核心靶点PPI网络图

表2 枸杞子-菊花药对治疗DR核心靶点

2.4 核心靶点GO富集分析将枸杞子-菊花药对治疗DR的30个核心靶点输入Metascape在线平台进行GO富集分析,得到生物过程(biological process,BP)919个、细胞组分(cellular component,CC)23个、分子功能(molecular function,MF)47个。生物过程主要包括细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、对氧气水平下降的反应(response to decreased oxygen levels)、对氧气水平的反应(response to oxygen levels)、细胞迁移的正向调节(positive regulation of cell migration)、细胞运动的正向调节(positive regulation of cell motility)、细胞成分运动的正向调节(positive regulation of cellular component movement)、运动的正向调节(positive regulation of locomotion)、凋亡信号通路的调控(regulation of apoptotic signaling pathway)、对缺氧的反应(response to hypoxia)、对激素的反应(response to hormone)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)、对无机物质的反应(response to inorganic substance)、腺体发育(gland development)、小分子代谢过程的正调控(positive regulation of small molecule metabolic process)、蛋白质磷酸化的正调控(positive regulation of protein phosphorylation)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、细胞对生长因子刺激的反应(cellular response to growth factor stimulus)等;细胞组分主要涉及质膜穴样内陷(caveola)、薄膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、质膜膜筏(plasma membrane raft)等;分子功能主要与转录协同调节因子结合(transcription coregulator binding)、细胞因子活性(cytokine activity)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、受体配体活性(receptor ligand activity)、蛋白酶结合(protease binding)、蛋白激酶结合(protein kinase binding)、生长因子受体结合(growth factor receptor binding)等相关。结果表明,枸杞子-菊花药对通过多种生物过程及分子功能干预DR发展进程。见图5。

图5 枸杞子-菊花核心靶点GO富集分析柱状图

2.5 核心靶点KEGG信号通路富集分析将枸杞-菊花药对治疗DR的30个核心靶点输入Metascape在线平台进行KEGG信号通路富集分析,得到134条信号通路,根据校正P值筛选出排名前20位的信号通路,其中包括癌症通路(pathways in cancer)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetes complications)、白细胞介素-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、人巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、肿瘤坏死因子信号通路(tumor necrosis factor signaling pathway)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B signaling pathway)、丝裂原活化蛋白激酶信号通路(mitogen activated protein kinase signaling pathway)、膀胱癌(bladder cancer)、非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease)、乙型肝炎病毒(hepatitis B)、酒精性肝病(alcoholic liver disease)、乳腺癌(breast cancer)、细胞衰老(cellular senescence)、丙型肝炎(hepatitis C)等,以上结果表明枸杞子-菊花药对通过多种信号通路治疗DR。见图6。

图6 KEGG信号通路富集分析气泡图

2.6 “活性成分-作用靶点-信号通路-DR”网络将活性成分、核心靶点、信号通路导入Cytoscape 3.9.1软件构建“活性成分-作用靶点-信号通路-DR”网络,该网络中有207个节点和782条边,蓝色圆形节点代表药物活性成分,粉色正六边形节点代表信号通路,黄色矩形代表成分作用靶点,节点的大小及颜色的深浅代表其对应Degree值,节点越大颜色越深代表该节点越重要。根据网络图可直观的看出枸杞子、菊花药对通过槲皮素(A1)、β-谷甾醇(A2)、山柰酚(JH7)、木犀草素(JH9)、柚皮素(JH14)等活性成分作用于PTGS2、RELA、CASP3、AKT1、MAPK3、TP53、IL-6等靶点调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等。上述结果表明,枸杞子-菊花药对通过多成分、多靶点、多通路作用于DR。见图7。

图7 “活性成分-作用靶点-信号通路-DR”网络

3 讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见的微血管并发症之一,现代中医将其称为“消渴内障”“消渴目病”,其发病多因消渴日久,肾阴亏虚,水不涵木,导致肝阴肝血不足,目睛失于濡养,亦或是肝阴亏虚,虚火上炎灼伤目络,热迫血妄行而致视力急速下降,甚至暴盲[12]。在《秘传证治要诀及类方》中有“三消久之,精血既亏,或目无所见,或手足偏废”的记载,进一步验证了消渴病所导致的目疾多因肝肾精血不足,不能上承目窍所致[13]。《秘传眼科龙木论》所言“肾是肝之母,今肾受风毒,故令肝虚,肝虚则目中恍惚”,说明消渴以肾虚为先,日久虚火内生耗竭肾阴,进而损伤子脏,导致肝肾亏虚,并发消渴目病[14]。针对消渴目病的发病机制,遣方施治不仅需要滋补肝肾,同时应配伍轻清上浮之品,以达到标本兼施、补而不滞之功效[15]。枸杞子味甘性平,归肝肾二经,具有滋养肝肾、益精明目之功效;菊花味甘、苦,性微寒,归肝肺二经,有平肝明目,散风清热之功效[16];枸杞子以补为主、菊花以清为要,枸杞子滋肾精、益肝血,补肝肾之阴以明目,菊花疏散风热、清肝明目,两者相互配伍,既滋肾养肝明目治其本,又清肝泻热以治其标,一补一清,滋水涵木,成为中医药防治糖尿病视网膜病变极佳药对[17]。

本研究通过构建药对-活性成分-作用靶点网络图发现,槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山柰酚(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)可能是枸杞子-菊花药对治疗DR的核心活性成分。槲皮素属于类黄酮化合物,具有抗氧化、炎症、肿瘤、新生血管生成等功效[18]。高迁移率族蛋白(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是慢性组织炎症的重要起始因子。高糖诱导HMGB1过度表达,与Toll样受体4(toll-like Receptor 4,TLR4)结合后,导致核因子-κB(the nuclear factor-κB,NF-κB)的活性增加,并诱导下游效应物NLRP3炎症小体的合成,促进Caspase-1、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的成熟,参与机体的炎症反应[19]。研究表明,槲皮素可以抑制HMGB1/TLR4/NF-κB/NLRP3炎症小体/IL-1β/IL-18轴,减少促炎因子的释放,抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和可溶性细胞间黏附分子-1(soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)分泌,阻止视网膜新生血管生成,此外,槲皮素还通过诱导血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)上调视网膜脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达,保护视网膜神经节细胞,改善高糖诱导下视网膜组织学的改变[20]。

β-谷甾醇是一种植物甾醇,具有降胆固醇、降血糖和抗炎等多种功效[21]。研究发现,β-谷甾醇可改善糖尿病诱导的大鼠的血糖、血清胰岛素、脂质谱、氧化应激标志物、抗氧化酶、胰岛素受体(insulin receptor,IR)和葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter type 4,GLUT4)的改变,从而促进GLUT4合成和葡萄糖吸收,来改善血糖控制[22]。

山柰酚是一种低分子量天然黄酮类化合物,可调节与凋亡、血管生成、自噬、炎症等相关的细胞信号转导通路[23]。视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)损伤是导致DR病程进展的重要因素之一,糖脂毒性引起的氧化应激为RPE损伤的主要诱因。山柰酚通过参与Bax/Bcl-2和Caspase-3信号通路以及抑制血管内皮生长因子基因表达保护人RPE细胞(RPE-19)免受过氧化氢诱导的损伤和凋亡,从而延缓DR病程的进展[24]。

木犀草素是一种天然存在的黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗癌等功效[25]。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白1(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 1,NLRP1)和NLRP3促进IL-18和IL-1β的表达,从而激活Caspase-1导致DR中视网膜组织进行性损伤[26]。研究发现,木犀草素可以减少NLRP1、还原型辅酶Ⅱ氧化酶-4 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase type 4,NOX4)、NLRP3蛋白的表达并调节NLRP/NOX4信号通路预防糖尿病视网膜病变大鼠视网膜细胞凋亡[27]。柚皮苷是一种天然黄酮苷化合物,其具有较强的抗炎和抗氧化活性[28]。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)信号通路是抵抗氧化应激损伤的主要途径。一旦机体发生氧化应激,Nrf2在细胞核中与抗氧化响应元件(antioxidant response element,ARE)结合,保持氧化和抗氧化之间的平衡,维持细胞的正常功能[29]。柚皮素通过激活Nrf2-ARE信号通路,提高大鼠视网膜组织Nrf2、HO-1和NQO1蛋白水平,发挥对DR大鼠氧化应激的保护作用[30]。

构建PPI蛋白互作网络及并进行可视化分析发现,AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53等可能是枸杞-菊花药对治疗DR的关键靶点,进一步进行KEGG通路富集分析,结果表明上述关键基因主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、TNF、PI3K-AKT等信号通路。晚期糖基化终产物在糖尿病并发症的病理生理学中起重要作用。糖尿病持续性的高血糖状态导致蛋白质、脂质和核酸发生一系列非酶糖基化反应,该反应会导致晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)的产生[31]。所产生的AGEs与其主要细胞受体RAGE结合激活下游信号因子,如应激活化蛋白激酶/c-Jun N-末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase,SAPK/JNK)和Ras介导的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2,ERK1/2)和Janus激酶/信号转导子和转录激活因子(Janus kinases/ signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)通路,使转录因子如 NF-κB、信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF1)和AP-1的持续激活,导致氧化应激和炎症增强[32]。研究表明,通过抑制 AGEs/RAGE/NF-κB通路来下调炎症因子的表达可改善糖尿病大鼠视网膜内、外核层的水肿情况,减少神经节细胞的丢失[33]。

白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)属于IL-17家族的标志性细胞因子,是一种促炎细胞因子[34]。Müller细胞是视网膜的主要神经胶质细胞,参与血-视网膜屏障的形成,调节视网膜谷氨酸盐代谢,并支持视网膜神经元存活。IL-17A经 IL-17 受体A(IL-17RA)激活Act1-TRAF6-IKK-NF-κB信号通路损害Müller细胞功能,导致糖尿病视网膜病变恶化[35]。

HIF-1信号通路主要控制组织或细胞对缺氧的适应。HIF-1α是HIF家族成员中的关键因子,参与细胞存活、血管生成、能量代谢[36]。研究发现,HIF1α所诱导的HIF1α-PFKFB3通路与DR病理性血管生成和神经变性相关。一方面,HIF-1α激活下游PFKFB3决定内皮末梢细胞的竞争促使萌芽血管生成。另一方面,PFKFB3驱动的糖酵解损害了神经元的抗氧化能力,导致神经元损伤和反应性神经胶质增生,因此,抑制HIF1α-PFKFB3通路可减少新生血管生成及视网膜神经变性,有助于延缓DR的病程进展[37]。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是自噬中常见的通路,在调节细胞存活、分化、增殖和迁移中起重要作用[38]。自噬是溶酶体介导的降解过程,在细胞内环境的稳态中起关键作用,然而过度激活的自噬可能导致视网膜变性疾病早期阶段的细胞死亡,加快疾病进展[39]。研究发现,人参皂苷Rg3能够通过激活 PI3K-AKT/PKB信号通路,下调血管内皮生长因子和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)蛋白的表达,从而抑制细胞凋亡,保护糖尿病视网膜病变大鼠的视网膜组织[40]。

TNF-α是单核细胞因子的一种,广泛表达于人体的视网膜色素上皮细胞、米勒细胞、脉络膜血管内皮细胞等眼视网膜基底膜等多种细胞中。在高糖条件下,TNF-α经米勒细胞释放,激活EGFR/p38/NF-κB/p62通路,增加视网膜色素上皮细胞的有丝分裂和凋亡,加速DR的发病[41]。此外,TNF-α增强活性氧的合成以及IL-6、血管内皮细胞中黏附分子的表达,促进白细胞从血流渗透到视网膜,加重视网膜内的炎症反应,诱导内皮细胞损伤[42]。

综上所述,枸杞子-菊花药对可能通过槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、木犀草素、柚皮素等药物活性成分作用于AKT1、IL-6、VEGFA、TNF、TP53等关键靶点,进而通过调控AGE-RAGE、IL-17、HIF-1、TNF、PI3K-AKT等信号通路,调节机体氧化应激、炎症反应、糖脂代谢等生物过程参与DR发生、发展过程。本文基于网络药理学技术从复杂的生物网络角度将系统生物学、药理学、信息网络、计算机等学科深度融合,揭示了枸杞子-菊花药对防治DR的作用机制,为下一步基础研究、药物研发等提供了科学依据及理论基础。