AA肉鸡和如皋黄鸡海马和下丘脑GR和FKBP5的表达及其与应激敏感性的关系

2023-11-30赵敏蝶赵茹茜

畜牧兽医学报 2023年11期

刘杰,丛玮,赵敏蝶,赵茹茜*

(1.南京农业大学动物医学院,南京 210095;2.农业农村部动物生理生化重点实验室,南京 210095)

在规模化养殖中,应激会影响肉鸡的健康,并造成巨大的经济损失。品种的选育提高了肉鸡的生长性能,也改变了肉鸡对环境的适应能力和应激敏感性。不同品种的鸡对各种急性和慢性应激的抵抗能力不同,包括急性或慢性热应激[1-2]、慢性冷应激[3]、约束应激[4]等。应激反应由下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)调节[5]。应激会激活HPA轴释放糖皮质激素(glucocorticoid,GC),而海马和下丘脑中的糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)通过与GC结合[6],负反馈调节HPA轴来终止应激反应。慢性应激可引起HPA轴过度激活和GCs水平持续升高,导致中枢GR表达下调,HPA轴的负反馈调节机制受损。与白来航鸡相比,红原鸡对急性应激表现出更强的行为和生理反应,但能够更快地恢复正常水平,说明红原鸡可以更好地应对环境应激[7]。因此,HPA轴的负反馈能力在调节鸡的应激反应中至关重要。

FK506结合蛋白5(FK-506 binding protein 5,FKBP5)是GR的分子伴侣,通过减少GR与GC结合和阻碍GC/GR复合物向细胞核的转运来调节GR的功能[8-9]。GR作为FKBP5的转录因子,其激活会诱导FKBP5转录增加,FKBP5与热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)相互作用阻止GC/GR复合物向核的易位,在细胞中形成超短负反馈环路[10-11]。通过这一过程,FKBP5降低了应激后GR对GC的敏感性。海马和下丘脑在HPA轴的反馈抑制中起着重要作用。FKBP5在多种应激性精神疾病患者或动物模型的外周血、海马和下丘脑表达增加[12-15]。体外研究发现,抑制FKBP5可以促进海马神经元的生长、分化和增殖[16-17]。FKBP5在小鼠下丘脑的基础表达水平较低,但在地塞米松暴露或应激原刺激后,FKBP5显著增加[18]。鸟类的大脑中也发现了同样的变化,并且FKBP5表达与HPA轴的灵敏度呈负相关,下丘脑FKBP5表达越高,对GR的抑制作用越强,导致GR对HPA轴的负反馈功能受损,使得应激后升高的血浆CORT水平不能及时恢复,从而导致持续应激和行为异常[19]。因此,FKBP5作为治疗应激相关疾病的潜在药物靶点而备受关注,而肉鸡应激敏感性的品种差异是否与海马和下丘脑FKBP5表达有关尚不清楚。

本研究选取AA肉鸡和如皋黄鸡,通过皮下注射皮质酮建立慢性应激模型,分析海马和下丘脑GR和FKBP5的表达是否与应激敏感性有关。研究发现,AA肉鸡抗应激能力较差,这与海马和下丘脑GR和FKBP5表达的差异有关。研究结果为抗应激肉鸡品种选育和肉鸡应激调控提供了新的靶点。

1 材料与方法

1.1 动物模型和样品采集

选用1日龄(d)雄性AA肉鸡(购自江苏京海禽业集团有限公司)和如皋黄鸡各40只(购自江苏省家禽科学研究所)。肉鸡在密闭鸡舍内3层叠层笼养,每笼3只鸡,自由采食和饮水,肉鸡配合饲料购自新希望六和。每天光照16 h,黑暗8 h。35 d时,分别将AA肉鸡和如皋黄鸡随机分为对照组(n=20)和CORT组(n=20)。CORT组连续10 d每天两次皮下注射CORT(C104537,阿拉丁)建立慢性应激模型[20-21],剂量为4.0 mg·(kg·d)-1。每天记录采食量,每7 d称量体重。45 d屠宰,采集抗凝血用于血浆分离。参考鸡脑部图谱[22-23]对海马和下丘脑组织进行采集,置于液氮速冻,并保存于-80 ℃。

1.2 紧张性不动(tonic immobility, TI)测试

TI测试通常用于评估动物的恐惧和应激反应程度。在CORT处理前和处理后进行TI检测。在一个安静的房间里,将鸡背部朝下平放在桌面上,用手轻轻地固定住鸡的胸部和头部。若10 s内鸡没有翻身,则诱导成功,开始记录时间,直到鸡翻身站起。如果鸡平躺时间超过4 min,停止计时,记录时间240 s。

1.3 血浆生化指标测定

将采集的抗凝血置于冰上,3 500 r·min-1离心10 min,收集血浆。使用生化分析仪(Hitachi,日本)检测血浆三酰甘油(TG)(H201)、葡萄糖(GLU)(H108)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)(H001)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)(H002),试剂盒均购自美康生物科技股份有限公司。采用ELISA检测血浆CORT含量,按照鸡皮质酮检测试剂盒(0160c,Elbscience)说明书上的操作步骤测定。

1.4 异嗜性粒细胞/淋巴细胞比率

异嗜性粒细胞/淋巴细胞(heterophil/lymphocyte, H/L)比率的变化反映肉鸡的应激程度,可以作为检测肉鸡应激程度的指标。从翅静脉采集血液制备血涂片,用瑞氏染液(G1040,索莱宝)和姬姆萨染液(G1010,索莱宝)染色。显微镜下随机选择视野,共计数100个白细胞,包括淋巴细胞和异嗜性粒细胞,计算异嗜性粒细胞与淋巴细胞的比值。

1.5 总RNA提取和qPCR

采用Trizol法提取总RNA,使用逆转录试剂盒(AE341,全式金)合成cDNA。参考GenBank设计相关引物(表1)。使用ABI快速实时PCR系统(QuantStudioTM6 Flex,Applied Biosystems,美国)进行实时荧光定量PCR,检测相关基因的mRNA表达水平。相对基因表达量采用2-ΔΔCt法计算。

表1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers

1.6 蛋白提取和Western blot检测

RIPA裂解液配制:1% Triton-100,0.5%脱氧胆酸钠,150 mmol·L-1NaCl,0.1% SDS,50 mmol·L-1Tris以及1%蛋白酶抑制剂(B14001,Bimake)。用RIPA裂解液提取组织蛋白,用BCA蛋白检测试剂盒(DQ11,全式金)测定蛋白浓度。用20 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。鸡GR抗体(本实验室自制,1∶2 000)或FKBP5抗体(ab46002,Abcam,1∶250)4 ℃孵育过夜。次日,使用二抗(bl003a,Biosharp,1∶100 000)室温孵育1 h后,使用ECL化学发光试剂盒(bl523,Biosharp)进行孵育显影。使用ImageJ进行条带灰度定量分析。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 AA肉鸡和如皋黄鸡应激敏感性的差异

为了比较不同品种肉鸡的应激敏感性,使用CORT处理AA肉鸡和如皋黄鸡模拟慢性应激。结果显示,AA肉鸡的生长速度比如皋黄鸡快(图1A)。CORT处理后,AA肉鸡的体重显著下降(P<0.001),而如皋黄鸡的体重没有变化(图1B)。CORT处理没有改变AA肉鸡和如皋黄鸡的采食量(图1C)。行为学试验结果显示,正常情况下如皋黄鸡的TI持续时间显著高于AA肉鸡(P<0.05),CORT可显著提高AA肉鸡的TI持续时间(P<0.01),而如皋黄鸡则无明显变化(图1D)。

A. 1～35 d体重;B. 45 d体重;C. 36～45 d采食量;D. TI静止时间;E. 血浆皮质酮含量;F. 血液中H/L;G. 血涂片染色(标尺=20 μm)。图中所标字母相异表示差异显著(P<0.05),所标字母相同表示差异不显著(P>0.05)。下同A. Body weight from 1 day to 35 days of age; B. Body weight at 45 days of age; C. Feed intake from 36 to 45 days of age; D. Tonic immobility time; E. Corticosterone content in plasma; F. Heterophil/Lymphocyte ratio in blood; G. Blood smear staining (bar=20 μm). Different letters mean significant difference (P<0.05), same letter means not significant difference (P>0.05). The same as below图1 AA肉鸡和如皋黄鸡体重、TI持续时间和血液指标Fig.1 Body weight, TI duration and blood indexes of AA and Rugao broiler chickens

血浆CORT水平和H/L比值是反映机体应激水平的重要指标。AA肉鸡和如皋黄鸡血浆CORT的基础水平无差异,但CORT处理后AA肉鸡血浆CORT水平显著升高(P<0.01,图1E),如皋黄鸡没有变化。品种间H/L的基础水平无差异,CORT处理后,AA肉鸡和如皋黄鸡血液中异嗜性粒细胞增加,H/L均显著升高(P<0.001),但AA肉鸡明显高于如皋黄鸡(P<0.05)(图1F、G)。

对下丘脑和海马中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的mRNA表达进行检测,发现CORT导致AA肉鸡下丘脑GPX3和SOD1表达上调(P<0.05)(图2A～D),以及海马中GPX1、GPX3、SOD1、SOD3表达上调(P<0.05)(图2E～H),但如皋黄鸡没有变化,说明CORT导致AA肉鸡下丘脑和海马发生氧化损伤,激活抗氧化酶表达。

A.D. 下丘脑GPX1、GPX3、SOD1、SOD3 mRNA表达;E～H. 海马GPX1、GPX3、SOD1、SOD3 mRNA表达 A-D. GPX1, GPX3, SOD1 and SOD3 mRNA expression in hypothalamus; E-H. GPX1, GPX3, SOD1 and SOD3 mRNA expression in hippocampus图2 AA肉鸡和如皋黄鸡下丘脑和海马中抗氧化相关基因mRNA表达Fig.2 mRNA expression of antioxidant genes in hypothalamus and hippocampus of AA and Rugao chickens

2.2 CORT对AA肉鸡和如皋黄鸡血浆中TG、ALT和AST的影响

对AA肉鸡和如皋黄鸡血浆TG和GLU浓度,以及ALT和AST活性进行检测(表2)。结果显示,CORT处理后AA肉鸡和如皋黄鸡TG水平均显著升高(P<0.01)。AA肉鸡和如皋黄鸡GLU在基础水平和CORT处理后均没有差异。AA肉鸡ALT和AST的基础水平显著高于如皋黄鸡(P<0.01)。CORT处理后,AA肉鸡的ALT显著降低(P<0.001),AST显著升高(P<0.01),从而导致AST/ALT显著升高(P<0.001),而如皋黄鸡没有变化。结果表明CORT引起AA肉鸡的肝损伤更严重。

表2 AA肉鸡和如皋黄鸡血浆生化指标Table 2 Plasma biochemical parameters of AA and Rugao

2.3 CORT对AA肉鸡和如皋黄鸡海马及下丘脑GR与FKBP5表达的影响

中枢的GR和FKBP5在应激反应中起着重要作用,为了探究在品种间是否存在差异,作者对海马、下丘脑中GR和FKBP5在mRNA、蛋白水平的表达进行了检测。结果表明,海马中GR和FKBP5 mRNA的基础表达水平在两个品种间没有差异。CORT处理后AA肉鸡海马中GRmRNA显著下降(P<0.05,图3A),FKBP5 mRNA显著上调(P<0.01,图2B),而如皋黄鸡GR和FKBP5 mRNA没有变化(图3A、B)。如皋黄鸡海马中GR蛋白的基础表达量显著高于AA肉鸡(P<0.001),CORT处理导致AA肉鸡和如皋黄鸡海马的GR蛋白表达均显著下调(P<0.001),但应激后如皋黄鸡的GR蛋白表达量仍显著高于AA肉鸡(P<0.001)(图3C)。AA肉鸡和如皋黄鸡海马中FKBP5蛋白表达的基础水平没有差异,在CORT处理后均显著增加(P<0.001),但应激后AA肉鸡FKBP5蛋白表达量仍显著高于如皋黄鸡(P<0.001)(图3D)。

下丘脑中GRmRNA在两个品种和处理之间没有变化(图4A)。CORT处理后AA肉鸡下丘脑中FKBP5 mRNA显著上调(P<0.01),而如皋黄鸡没有变化(图4B)。如皋黄鸡下丘脑GR蛋白的基础表达量显著高于AA肉鸡(P<0.05,图4C),CORT处理导致AA肉鸡和如皋黄鸡下丘脑的GR蛋白表达均显著下调(P<0.01),但应激后如皋黄鸡的GR蛋白表达量仍显著高于AA肉鸡(P<0.05)(图4C)。AA肉鸡和如皋黄鸡下丘脑中FKBP5蛋白表达的基础水平没有差异,在CORT处理后均显著增加(P<0.001),但应激后AA肉鸡FKBP5蛋白表达量仍显著高于如皋黄鸡(P<0.001)(图4D)。

2.4 GR和FKBP5蛋白表达水平与血浆皮质酮含量的相关性分析

血浆皮质酮含量与应激反应有关,作者对海马和下丘脑中GR和FKBP5的蛋白表达水平与血浆皮质酮含量进行相关性分析,结果表明,海马(r=-0.535 5,P=0.007 0,图5A)和下丘脑(r=-0.555 3,P=0.004 8,图5B)中GR的蛋白表达与血浆皮质酮含量呈负相关,海马(r=0.593 9,P=0.002 2,图5C)和下丘脑(r=0.694 7,P=0.000 2,图5D)中FKBP5的蛋白表达与血浆皮质酮含量呈正相关。表明GR与FKBP5的表达水平能够反映肉鸡的应激程度。海马(r=-0.713 0,P<0.000 1,图5E)和下丘脑(r=-0.666 7,P=0.000 4,图5F)中GR与FKBP5的蛋白表达呈负相关,表明CORT导致GR表达的降低与FKBP5增加有关。

A. GR mRNA表达;B. FKBP5 mRNA表达;C. GR蛋白表达;D. FKBP5蛋白表达A. GR mRNA expression; B. FKBP5 mRNA expression; C. GR protein expression; D. FKBP5 protein expression图3 AA肉鸡和如皋黄鸡海马中GR和FKBP5 mRNA和蛋白表达Fig.3 mRNA and protein expression of GR and FKBP5 in hippocampus of AA and Rugao chickens

3 讨论

增强抗应激能力有利于肉鸡的生长,提高肉鸡生产的经济效益。因此,提高肉鸡的抗应激能力对生产极为重要。已有研究发现不同品种肉鸡的应激敏感性存在差异[1,24-25]。本研究证明如皋黄鸡比AA肉鸡抗应激能力更强。AA肉鸡和如皋黄鸡的海马和下丘脑中GR的基础表达水平和CORT诱导的FKBP5表达存在差异,与应激敏感性有关。

为了满足对畜禽肉产品日益增长的需求,经过近几十年的人工选育,肉鸡的生长速度不断增加,同时应激敏感性也发生改变[26-27]。AA肉鸡为我国白羽肉鸡工厂化生产的主要品种之一,特点为体型大、生长发育快、饲料转化率高。如皋黄鸡生长较慢,属肉蛋兼用型地方品种。已有研究发现,生长缓慢的品种对应激有更好的抵抗力。在急性热应激试验中,科宝500肉鸡的体温、H/L、血浆CORT含量和脑中HSP70表达均有升高,而红原鸡和土种鸡没有变化[28]。慢性热应激试验中也得到相似的结果[29]。限饲引起的慢性应激使血浆CORT含量增加,应激后快速型肉鸡血浆中的CORT含量增加了2.48倍,而慢速型肉鸡仅增加了1.30倍[24]。作者的研究结果与以上研究结果一致,通过皮下注射CORT模拟慢性应激,AA肉鸡体重显著降低,H/L比率和血浆CORT含量显著升高,说明AA肉鸡的应激反应比如皋黄鸡更强烈。TI测试和循环皮质酮水平通常用于评估恐惧和应激反应。在本研究中,AA肉鸡的TI时间在基线时低于如皋黄鸡,在CORT处理后升高,此外,AA肉鸡血浆CORT含量也显著升高,而如皋黄鸡的TI时间和血浆CORT含量没有改变。研究发现,选育可以改变鸡对应激源的恐惧程度,红原鸡比家养鸡表现出更多的恐惧行为,以及不同的应激恢复模式[30]。在急性应激后,红原鸡的行为反应迅速,CORT变化更为显著,并更快地恢复到基础水平[7,31]。和AA肉鸡相比,如皋黄鸡选育程度可能较低,其应激反应与红原鸡相似,在自然状态下高度警惕,但在受到应激时能够迅速恢复。

HPA轴能够调节机体的适应能力。GR是机体应激反应系统的关键组成部分,也是GC结合的主要受体。GR在大脑中大量表达,负反馈抑制GC诱导的HPA轴激活,在应激和精神活动中起着重要的调节作用。研究发现,在红原鸡和白来航鸡的海马中GRmRNA没有差异,而白来航鸡下丘脑中GRmRNA高于红原鸡[4]。也有研究发现科宝肉鸡下丘脑中GR mRNA和蛋白表达高于白来航鸡[32]。在作者的试验中,GRmRNA的基础表达水平在两个品种间没有差异,但在蛋白水平,如皋黄鸡海马和下丘脑中GR的基础水平高于AA肉鸡,说明如皋黄鸡中枢的GR对HPA具有更强的负反馈调节作用。PTSD和抑郁模型小鼠的海马和下丘脑中GR表达降低[33-34]。CORT处理也会导致鸡下丘脑GR蛋白表达下调[35],在本研究中观察到相同的结果。

GR主要以复合物的形式存在于细胞质中,FKBP5是其分子伴侣之一。FKBP5可以调节GR敏感性和HPA轴功能,并与许多应激相关的精神疾病有关。FKBP5是GR的负反馈调节因子,高水平的FKBP5会减少GR入核,引起糖皮质激素抵抗[36]。GR-FKBP5蛋白复合物在PTSD患者和小鼠模型中增加。破坏GR-FKBP5结合可促进GR核易位,降低小鼠恐惧记忆的巩固和回忆[37]。应激后麻雀下丘脑中FKBP5表达越低,HPA轴越灵活[19]。本研究中,GR与FKBP5的表达呈负相关,并且CORT使AA肉鸡海马和下丘脑FKBP5蛋白比如皋黄鸡增加更多,表明AA肉鸡FKBP5可能与GR结合更多,形成GR-FKBP5蛋白复合物,阻止GR进入细胞核,使GR不能发挥对HPA轴的抑制作用。

GC含量反映机体的应激水平,可以作为应激反应的生物标志物。GC高分泌与应激相关精神疾病有关,通常伴随着GR低表达和FKBP5高表达[38]。作者发现肉鸡循环皮质酮与海马和下丘脑中GR的表达呈负相关,与FKBP5的表达正相关,表明海马和下丘脑中GR和FKBP5的表达水平可以反映肉鸡的应激程度,并与应激敏感性有关。因此,GR和FKBP5可以作为肉鸡育种筛选的候选基因。在应激相关精神疾病中GR和FKBP5表达变化与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)有关[39-40]。在畜禽养殖中SNPs被应用于育种筛选。已有研究发现猪肝和皮肤中GR SNPs与应激反应和攻击行为有关,可以作为育种标记[41]。本研究结果中,AA肉鸡和如皋黄鸡下丘脑和海马中GR和FKBP5在应激反应中的表达差异可能与SNPs有关,需要进一步探究。