可降解材料生物降解率的检测方法比较

赵 伟,李 宇,张 玮,朱科桦,周 珂,吕 晴,刘诗娴,葛振鸣

（1.华东师范大学 河口海岸学国家重点实验室,上海 200241;2.3M 中国有限公司 中国研发中心,上海 200233）

0 引 言

塑料由于其较低的成本、高耐用性和强柔韧性且易于加工和运输等优点,已被广泛应用于建筑、医疗和农业等各个行业.但大量难降解的塑料制品废弃后,由于不当处置会导致环境污染、动物误食后死亡等严重后果.因此,近年来我国政府大力倡导和支持可生物降解材料的应用.因其具有良好的降解性能,且最终降解产物(CO2和H2O 等)不会对环境造成威胁,所以得到了许多科研机构及生产企业的青睐.在企业研发及生产可降解材料的过程中,检测产品的降解性能是极为重要的一个环节,而选择适宜的方法是进行降解率检测的前提条件.

现行标准的塑料生物降解方式可根据氧气条件和降解介质的不同分为淡水需氧环境(GB/T 19276.2)、海水需氧环境(ISO 22404)、土壤需氧环境(GB/T 22047)、堆肥需氧环境(GB/T 19277)、水性培养液厌氧消化环境(ISO 14853)、受控污泥厌氧消化环境(ISO 13975)等.测量方法主要包括测定降解过程中CO2的产量和密闭呼吸计中需氧量两种,降解检测时间最长可至24 个月.国际上的主流标准,包括美国标准ASTM D5338、欧盟标准EN 14995 和我国标准GB/T 19277,都是在有氧堆肥条件下降解材料,同时采用测定CO2产量的方法来计算降解率.然而,现行标准方法测定材料降解率的时间普遍较长(约6 个月),这不利于企业对可降解材料降解性能的快速评估,从而延迟了产品的研发和生产周期.因此,在现有的执行标准下,优化降解材料的处理方法以提高材料降解率的测定效率是十分必要的.

塑料的降解受到环境中非生物因素和生物因素的共同影响,降解方式有光降解、热降解、机械降解和生物降解[1].在生物降解过程中,主要是由动物、植物、微生物和酶发挥作用[2],其中微生物降解得到了广泛研究.许多微生物种群都具有塑料降解能力,如芽孢杆菌属(Bacillussp.)和假单胞菌属(Pseudomonassp.)微生物对聚合物有较好的降解效率[3].特定微生物主要通过在聚合物表面定殖,形成一层特殊的生物膜,并进一步分泌降解相关酶类来加速材料的降解.但在培养温度较高及测试周期较长的情况下,微生物的活性可能会受到抑制.而嗜热菌(thermophilic bacteria)在需氧或兼性厌氧环境下均可生长,而且会分泌降解聚合物内部结构的热稳定性酶,高于常温的温度也有利于嗜热菌在降解实验中发挥作用[4-5].Skariyachan 等[6]研究表明,从污水处理厂和垃圾填埋场中筛选出的两种嗜热菌的共同作用增强了对聚乙烯(polyethylene,PE)和聚丙烯(polypropylene,PP)聚合物的降解.因此,筛选适宜的菌株进行混合培养,有利于提高产品生物降解率测定的效率[2].

本研究共采用了4 种不同的降解处理方法,包括两种标准方法和两种特定微生物添加方法.测试材料为生产环保胶带所用的原纸、薄膜材料及胶带成品.通过评估材料在不同处理下的生物降解速率,筛选出能够更加有效和快速降解材料的方法,为企业缩短研发和生产周期等提供新的思路.

1 材料和方法

1.1 实验材料

根据中华人民共和国国家标准《受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法第1部分: 通用方法》(GB/T 19277.1—2011)[7],采用色谱级微晶纤维素(上海化学试剂公司)作为正控制参比材料.受测材料来自3M 中国有限公司提供的环保胶带(鉴于商业保密协议,未给出材料型号与配方),包括原纸、PLA(polylactic acid)薄膜和胶带成品3 种材料.试样材料基本参数如表1 所示.

表1 受测材料基本参数Tab.1 Basic parameters of the test materials

其他实验试剂和材料主要包括氢氧化钠(NaOH,分析纯,国药集团)、营养琼脂(北京陆桥技术股份有限公司)、枯草芽孢杆菌(3M 中国有限公司)、嗜热菌(鉴于商业保密协议,未给出菌株名称,3M 中国有限公司)、腐熟堆肥料(上海蔓香园林绿化有限公司)、蛭石(上海蔓香园林绿化有限公司).

1.2 实验装置与测定原理

实验装置简图如图1 所示.气泵和1 mol/L NaOH 用来提供无CO2的空气,生物降解培养瓶中排放出的气体可直接由红外气体分析仪进行测量.

图1 测定材料生物降解率的装置示意图Fig.1 Layout of the test system adopted for measuring material biodegradation rates

受测材料与受控堆肥混合后,受测材料在需氧生物分解过程中会产生CO2、水及腐殖质等物质.在生物降解实验过程中连续监测每日产生的CO2量,并计算CO2累积释放量.生物降解率即为实验周期内受测材料的CO2累积释放量和CO2理论释放量之间的比值.

整个测试周期所需要的仪器设备包括电热恒温培养箱、气泵和红外气体分析仪Li-840A(美国Li-Cor 公司).

1.3 方法设计与实验步骤

根据GB/T 19277.1—2011 的技术要求,测定材料生物分解能力可以采用堆肥和活化蛭石两种底物作为受测材料的反应固床.本研究设计了4 种不同的处理方法,对受测材料进行生物分解实验.

方法1: 将600 g 的腐熟肥料和100 g 的受测材料(预先进行裁切,约5 mm × 5 mm)混合均匀,放置在3 L 的培养瓶中.使用超纯水将混合物的相对湿度调节至50%～ 60%.培养瓶顶端有两个直径为7 mm 的气孔,用来连接气体分析仪和放有碱溶液的洗气瓶.记录下顶部空间体积用于后续的计算.

方法2: 将600 g 的蛭石和100 g 的受测材料(预先进行裁切,约5 mm × 5 mm)混合均匀,放置在3 L 的培养瓶中,添加500 mL 腐熟肥料浸提液,并配置营养液[7].使用超纯水将混合物的相对湿度调节至50%～ 60%.培养瓶顶端有两个直径为7 mm 的气孔,用来连接气体分析仪和放有碱溶液的洗气瓶.记录下顶部空间体积用于后续的计算.

方法3: 将600 g 的蛭石和100 g 的受测材料(预先进行裁切,约5 mm × 5 mm)混合均匀,放置在3 L 的培养瓶中,添加2.0 g 营养琼脂和20 mL 枯草芽孢杆菌菌悬液(1 × 108CFU/mL),并配置营养液[7].使用超纯水将混合物的相对湿度调节至50%～ 60%.培养瓶顶端有两个直径为7 mm 的气孔,用来连接气体分析仪和放有碱溶液的洗气瓶.记录下顶部空间体积用于后续的计算.

方法4: 将600 g 的蛭石和100 g 的受测材料(预先进行裁切,约5 mm × 5 mm)混合均匀,每个试验容器中加入2.0 g 营养琼脂和20 mL 嗜热菌菌悬液(1 × 108CFU/mL),并配置营养液[7].使用超纯水将混合物的相对湿度调节至50%～ 60%.培养瓶顶端有两个直径为7 mm 的气孔,用来连接气体分析仪和放有碱溶液的洗气瓶.记录下顶部空间体积用于后续的计算.

实验包括空白组(不加入受测材料)、参比组(纤维素)、受测材料组,每组3 个重复.样品混合后,使用水饱和的、不含CO2的、经1 mol/L NaOH 溶液吸收过的空气对混合物进行曝气处理,使用带弹簧止水夹的乳胶管将培养瓶密封后放入恒温培养箱,培养温度为(58±2)℃.在实验过程中,每周搅拌一次混合物,防止底部板结影响微生物的分解作用,隔3～ 4 d 根据实际情况补充水分,保证混合物的相对湿度.每隔约24 h 对每个培养瓶中产生的CO2进行测定,并计算材料的生物分解率.当降解率曲线处于上升期后的平稳状态时,此时的降解率即为材料在该方法下的最终生物降解率,测试周期为60 d.

1.4 分解率计算和数据分析

依照标准GB/T 19277.1—2011[7],绝对分解率(DT)公式:

式(1)中:DT为生物绝对分解率(%),TCO2为测试组的CO2累积释放量(g),BCO2为空白组的CO2累积释放量(g),tCO2为试验材料的CO2理论释放量(g).

相对分解率(DR)公式:

式(2)中:DR为生物相对分解率(%),DT-M为材料的绝对分解率(%),DT-R为参比的绝对分解率(%).

最终结果表示为每个处理中3 个重复的平均值,使用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著性差异法(least significant difference,LSD)多重比较相结合,检测在4 种不同的处理方法下,不同材料降解率的显著变化(p＜0.05).所有数据的分析使用Microsoft Excel 2019 和SPSS 20.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)完成,并且使用Origin 2018(Origin Lab,Northampton,MA,USA)绘图.

2 结果

2.1 材料在方法1(接种物: 腐熟堆肥料)下的降解情况

如图2 所示,在使用方法1 时,纤维素和原纸的CO2累积释放量的曲线具有相似的时间变化趋势,两种材料都在实验开始的前8 天快速分解,在第10 天后都进入平稳阶段.PLA 薄膜的分解在实验30 d 后趋于稳定.但对于胶带成品来说,在60 d 的实验周期中并没有快速降解阶段,CO2的累积释放量变化也较为平缓.在60 d 的实验周期中,使用方法1 测得的纤维素绝对降解率为77.0%,原纸绝对降解率为66.3%,PLA 薄膜绝对降解率为62.6%,原纸和PLA 薄膜的相对降解率都超过了80%.胶带成品的绝对降解率仅为6.4%.

图2 方法1 处理下CO2 累积释放量(a)和生物降解率(b)的变化(±SD)Fig.2 Cumulative carbon dioxide emissions(a)and the biodegradation rates of materials obtained(b)using method 1(±SD)

2.2 材料在方法2(接种物: 蛭石+腐熟堆肥浸提液)下的降解情况

如图3 所示,在使用方法2 时,受测材料在前10 天都有一定程度的分解,纤维素在第10～ 14 天内快速分解,第20 天后进入稳定期.PLA 薄膜在实验第26 天,CO2累积释放量达到高峰值后趋于稳定.原纸和胶带成品两种材料的降解在第9 天开始加快,一直持续到第30 天左右.在60 d 的实验周期中,使用方法2 测得的纤维素绝对降解率为75.2%,原纸绝对降解率为67.7%,PLA 薄膜绝对降解率为70.7%,原纸和PLA 薄膜的相对降解率都超过了90%.胶带成品的绝对降解率为20.1%.

图3 方法2 处理下CO2 累积释放量(a)和生物降解率(b)的变化(±SD)Fig.3 Cumulative carbon dioxide emissions(a)and the biodegradation rates of materials obtained(b)using method 2(±SD)

2.3 材料在方法3(接种物: 蛭石+芽孢杆菌)下的降解情况

如图4 所示,在使用方法3 时,纤维素和原纸在降解周期的前10 天快速分解,然后进入稳定期.PLA 薄膜的分解阶段主要集中在前40 天,并且第20～ 40 天的降解速率高于第0～ 20 天的降解速率.胶带成品的降解过程具有明显的迟滞期,在第20 天左右快速分解,而后分解速率降低.在60 d 的实验周期中,使用方法3 测得的纤维素绝对降解率为71.0%,原纸绝对降解率为64.3%,PLA 薄膜绝对降解率为66.3%,原纸和PLA 薄膜的相对降解率都超过了90%.胶带成品的绝对降解率为27.7%.

图4 方法3 处理下CO2 累积释放量(a)和生物降解率(b)的变化(±SD)Fig.4 Cumulative carbon dioxide emissions(a)and the biodegradation rates of materials obtained(b)using method 3(±SD)

2.4 材料在方法4(接种物: 蛭石+嗜热菌)下的降解情况

在使用方法4 时,相比于其他3 种方法,胶带成品和PLA 薄膜的CO2累计释放量达到相对稳定状态所用的时间更长,持续了40 d 左右(图5).纤维素和原纸的快速分解主要集中在前8 天,没有出现分解前的迟滞期.在60 d 的实验周期中,使用方法4 测得的纤维素绝对降解率为71.2%,原纸绝对降解率为63.5%,PLA 薄膜绝对降解率为70.2%,原纸和PLA 薄膜的相对降解率都超过了90%.胶带成品的绝对降解率为48.2%,相对降解率为69.7%.

图5 方法4 处理下CO2 累积释放量(a)和生物降解率(b)的变化(±SD)Fig.5 Cumulative carbon dioxide emissions(a)and the biodegradation rates of materials obtained(b)using method 4(±SD)

2.5 材料在4 种方法间降解率的比较

根据执行标准GB/T 19277.1—2011 的要求,实验进行45 d 后,参比材料的生物分解率超过70%才为有效.因此,本实验最终结果达到规定标准.原纸在各种方法下的降解率差异不大(表2).PLA 薄膜在方法2、3、4 下的相对降解率均显著高于方法1(p＜0.05).胶带成品的降解率随着方法的优化显著提高(p＜0.05,表2),且在使用方法4 时测得了降解率的最大值,体现出快速降解的趋势.

表2 试样在4 种方法处理下的材料降解率的比较Tab.2 Comparisons between the degradation rates of samples obtained using the four methods

3 讨 论

本研究用于测试的材料为纤维素(参比)、原纸、PLA 薄膜和胶带成品.纤维素按照GB/T 19277.1—2011 要求的正控参比材料,降解率范围在71.0%～ 77.0%,这与多数研究的试验结果一致.例如,于镜华等[8]测试相同来源的纤维素生物降解率为73%,翁文宣等[9]的测试结果为76.9%.相对于参比材料的一致性,测试材料通常因研究而异,包括生物可降解的聚己内酯(polycaprolactone,PCL)、聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate,PBS)及不同材料成分的塑料制品[8,10-11].由于受测可降解产品一般为复合材料,故测试结果也具有一定的差异.例如,本研究中在堆肥条件下测得的PLA 薄膜的降解率范围在62.6%～ 70.7%,谢淑华等[12]对PLA 膜袋的试验结果为64.2%,扈蓉等[13]测得PLA 膜片的生物降解率为88.4%.

有研究表明,生物可降解材料在自然环境条件下的降解效速率较慢[14],且降解率低于受控环境下降解效率.Al Hosni 等[15]在受控条件和自然环境下测试了4 种复合材料(分别是PHB(poly-βhydroxybutyrate)、PCL、PLA、PBS)的生物降解率,结果表明,在较高温度的控制环境下,4 种聚合物都具有明显的重量损失,而在自然环境中除了PCL 外其他材料并没有出现明显的变化.同样地,Kim 等[16]也发现PBS 的降解率在受控环境下比自然条件下高得多.有些研究证明,通过添加葡萄糖等额外碳源[17]、紫外线提前处理塑料薄膜[18]、热处理塑料薄膜[19]、接种可降解塑料的菌种[20]等方法都能够提高传统材料的重量损失百分比,但其测试周期长(通常时间超过90 d 甚至达到1 年),并且效果有限(重量损失小于40%,甚至低于10%).因此,在室内受控堆肥条件下进行生物分解试验时,通过设计试验处理方法从而加速塑料的降解效率是有必要的.

本研究结果表明,在使用方法2、3、4 进行测试时,纤维素和原纸均在前10 天快速降解,随后降解率趋向稳定.这是因为原纸材料主要成分是植物纤维,其纤维素链通过氢键连接,植物纤维长链断裂是其降解过程的初始步骤[21].微生物分泌产生的降解酶对纤维素具有高效的降解作用.比如,芽孢杆菌和假单胞菌会分泌高活性的纤维素酶,从而可将其分解成低分子量化合物(如寡糖类、多糖类物质等)[22-23].而以上两种材料在方法2 下的降解期集中在第10～ 20 天,这可能是由于在没有外源添加微生物的条件下,腐熟堆肥浸提液中的微生物活性略低于原始堆肥,微生物需要一段时间的生长期再作用于受测材料.PLA 是一种以乳酸单体合成的、具有良好的生物降解性能的高分子聚合物,有氧条件下会被降解为终产物CO2和H2O[24].但在PLA 膜的制备过程中,通常会加入氯仿、冰乙酸、乙酸甲酯等溶剂用于溶解PLA,这可能会影响其降解性能.因此,受测材料降解机理和材料物化性质的差异可对降解现象的不同作出解释.

在不同方法下,原纸和PLA 薄膜的降解率无显著差异,而胶带成品在方法1 和方法2 下的降解率较低,在方法3 和方法4 下的降解率较高.这可能是因为胶带成品在性质上属于成分复杂的复合高分子聚合物,通常由离层型(塑料薄膜)、基材层(载体)及胶粘层(胶质)共同构成[25].在堆肥过程中,微生物需要对胶带成品进行逐层降解,复杂的结构使其对降解接种物有更高的选择性,降解过程中受到的影响也更为复杂.比如,较高的堆肥温度不利于非嗜热微生物的生长和繁殖,还可能会导致微生物死亡以及酶降解活动停止,从而会影响胶带成品的最终降解率[26].同时,方法1 和方法2 中的营养物和能量随着试验时间的增加会被微生物逐渐消耗,需要加入额外的能量来源以促进微生物的生长和生物降解[17,27],而不同的培养基通常可以提供不同的营养成分,包括碳源、氮源、生长因子和无机盐等[28],这有利于微生物的生长代谢和繁殖.因此,本研究为进一步加快材料的降解速率,在方法3 中加入了枯草芽孢杆菌菌悬液.芽孢杆菌属在塑料降解中发挥着重要作用,有研究表明,一种从塑料堆肥中提取出的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)会导致线性低密度聚乙烯(linear low density polyethylene,LLDPE)表面破碎[29];从土壤中分离得到的一种短小芽孢杆菌菌株(Bacillus pumilusstrain 1-A)对PBS 的降解率达到了90%(14 d),对聚丁二酸-己二酸丁二酯(adipic acid-1,4-butanediol-succinic acid copolymer,PBSA)树脂更是达到了100%[30].参与塑料生物降解的微生物存在于土壤、海水、堆肥等多种自然环境中,可以通过分泌不同的酶发挥作用,利用塑料作为碳源来加快聚合物的降解[25].多项研究已证明了微生物具有优良的可降解性能,在接种假单胞菌(Pseudomonassp.)一个月后的聚苯乙烯(polystyrene,PS)上可提取到对二甲苯等多种降解副产物[31];将PCL 和聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)薄膜接种在混合真菌悬液中28 d 后,薄膜出现明显的质量损失[32].本研究结果也证实了在加入相应菌悬液后,胶带成品的降解率有所提高.

本研究还发现,胶带成品在方法4 下的降解速率得到了较大的提升,这表明添加嗜热菌对塑料降解具有促进作用,且效果好于非嗜热特性的菌株.温度是影响塑料的生物降解过程的重要因素之一[33],但在这种特殊环境下,随着降解时间的增加,方法3 所加入的芽孢杆菌的作用可能会受到高温的限制.而嗜热菌在需氧或兼性厌氧环境下均可生长,其芽孢极具耐热性,较高的生长温度有利于嗜热菌在该塑料降解实验中发挥作用.曾有研究表明,嗜热艾登短芽孢杆菌(Brevibacillus aydinogluensis)可使得聚乙烯 醇(polyvinyl alcohol,PVA)降解率达到90%[34];栖热菌属(Thermusspp.)和芽孢杆菌(Bacillusspp.)在高温下可高效降解有机污染物PAHs[35];一种新型的嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株(strain A-2)可对原油重烃进行降解[36].还有研究指出,褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)分泌的胞外聚酯水解酶在55℃下作用3 周,对低晶体聚对苯二甲酸乙二酯的降解率可达50%[34].此外,塑料的降解过程并不能只依赖单一菌株[37-38],混合不同的嗜热菌用于生物降解实验也是可以选择的.

4 结 论

本研究通过设计不同的材料降解方法,以达到快速测定材料生物降解率的目的.结果表明,4 种方法中参比材料(纤维素)在60 d 的实验周期内绝对分解率均超过70%,满足了标准要求.实验材料包括原纸和PLA 薄膜的降解率(除PLA 薄膜的相对降解率以外)在4 种处理方法下无显著变化.测试胶带成品时,在方法1、方法2 下其降解率上升速率较低.而使用方法3(蛭石+芽孢杆菌)和方法4(蛭石+嗜热菌)时,胶带成品在60 d 内降解率显著高于前两种方法,且在方法4 下效果最佳.因此,优化降解方法大幅缩短了材料分解到达稳定期的时间,有利于加快材料降解率测定周期,可以一定程度上提高企业的研发效率.