蜂毒素—死亡素重组抗菌肽的小鼠毒性试验

刘小元,孟春颜,姬生跃,刘 勇

(1.修武县农业综合行政执法大队,河南 修武 454351;2.中基高科(北京)生物技术有限公司 ;3.西北农林科技大学 )

当前,细菌对抗生素耐药性问题日益严重,寻找新型替代抗菌剂是解决耐药性问题的重要途径,抗菌肽以其特有的优势被看作一种新型抗菌剂而备受关注。抗菌肽与抗生素比较具有耐环境因素影响,不易诱发耐药性的优点,当前在畜牧业生产中通过添加抗菌肽作为抑菌、促生长制剂显示出良好前景。

研究表明,通过在饲料中添加抗菌肽,可以明显提高动物的生长性能,并具有改善免疫力,减少动物发病,提高生长速度和效益的优势。但与抗生素相比,抗菌肽存在细胞毒性强、抑杀活性不稳定、生物学活性稳定性差的问题,需要通过对现有抗菌肽进行结构改造或设计新型抗菌肽,以满足新型抗菌剂研发的需要。

为了提高天然抗菌肽的抗菌活性、生物学稳定性并降低细胞毒性,我们应用抗菌肽分子设计技术方案,将蜂毒素和死亡素两种抗菌肽进行了重组,并用3个色氨酸残基对特定位点的氨基酸残基进行了替代,获得了蜂毒素—死亡素重组抗菌肽(MT-W)。初步研究发现MT-W相较于蜂毒素和死亡素对蛋白酶的稳定性显著增强、抗菌活性也明显提高而细胞毒性显著下降。

本试验目的在于将MT-W饲喂实验小鼠,通过检测实验鼠的生理生化指标,血液中MT-W的含量等,综合评估其对动物的潜在毒性,为进一步在养殖动物中实验提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 蜂毒素-死亡素毒素重组抗菌肽

抗菌肽MT-W通过构建的重组芽孢杆菌表达、提取纯化获得,并经冷冻干燥。用生理盐水配制成100 g/L的母液备用,4°C保存。

1.2 试验动物小鼠

昆明系成年小鼠200只,公母各半,平均体重18.5±1.5 g(北京斯贝福生物科技有限公司)。实验环境达到SPF水平,恒温恒湿(23±1°C、相对湿度60±5%),每日照明12 h,自由采食。

1.3 给小鼠口服急性毒性试验

将50只小鼠随机分为5个组,每组10只,公母各5只。试验组编号为I、II、III和IV,第V组为对照组。试验组小鼠按照600、1 200、2 500和5 000 mg/kg体重,分别口服MT-W稀释液,每日1次,连续使用15 d。对照组灌服0.5 mL灭菌生理盐水。第一次给药后15 d,禁食1 d后对所有小鼠进行称重,采集血液并分离血清;然后人道处死全部试验鼠,分别对其脏器进行采集后称重,主要包括心、肝、肺、胃、脾和淋巴结;观察所采脏器的变化;计算器官与体重的比值;检测碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、白蛋白、球蛋白、总蛋白、肌酸酐、血尿素氮、甘油三酯和总胆固醇等生化指标。

1.4 小鼠口服生物利用度

将MT-W溶液,按照50 mg/kg体重的剂量给60只小鼠(公母各半)进行试验处理,同时将生理盐水灌服60只对照组小鼠(公母各半)。从小鼠接受口服灌注开始计时,在第0.5 h,1 h,2 h,3 h,4 h,6 h,8 h,12 h,16 h和20 h,每组随机取出公母各半的6只小鼠用乙醚麻醉,从眼眶静脉丛采集血样,并将其放置在肝素管中,2000 r/min离心10 min,将分离的血于-20°C保存备用。

按照Hematyar等的方法进行血样中MT-W的检测。基本步骤如下:将采集的血样经0.22 μm孔径滤器(Nucleopore,Costar)过滤。用反相高效液相色谱系统(Agilent Technologies),反相高效液相色谱分析柱Zorbax300SB-C8(250 mm×4.6 mm,5 μm,300 A)(Agilent Technologies)对血样进行处理。用0.1%(v/v)三氟乙酸和10%乙腈平衡色谱柱,然后以0%～60%的乙腈梯度线性展开,流速为1.0 mL/min。监测214 nm和280 nm处的吸光度。

1.5 统计分析方法

通过t-检验进行统计学分析,P<0.05为差异显著。

2 试验结果

2.1 小鼠口服急性毒性试验结果

试验组和对照组小鼠灌服不同浓度的MT-W后未出现异常和死亡。且各试验组与对照组相比体重无差异;小鼠的器官/体重比率也无显著差异,表明MT-W溶液对小鼠没有明显毒副作用。结果见表1。

表1 实验鼠急性毒性试验检测指标汇总表

生化指标的检测结果表明,灌服MT-W的各组小鼠的主要生化指标与对照组相比无统计学差异(表2)。另外,在内脏器官中肉眼未观察到可见变化。

表2 实验鼠生化指标统计表

2.2 小鼠口服生物利用度试验结果

在按照50 mg/kg体重给实验小鼠灌服MT-W溶液后,10个检测时间点上在血浆中均未检测到MT-W,提示MT-W未在小鼠血液中残留。表明MT-W在口服后未被有效吸收,未在血液中累积到可检测的水平。

3 蜂毒素—死亡素重组抗菌肽(MT-W)试验讨论

利用动物模型来进行毒性分析研究,以评估某种物质对人类或生物体健康的潜在风险。为了评估MT-W的急性毒性,本研究用了小鼠作为动物模型,并在15 d的试验中对试验小鼠分别灌注了不同剂量的MT-W。结果显示,MT-W在500、1 000、2 000和5 000 mg/kg体重的剂量下,对小鼠无毒性作用,尽管5 000 mg/kg体重剂量的MT-W灌注的雄性小鼠的天冬氨酸氨基转移酶和血尿素氮水平有所升高,雌性小鼠的血尿素氮水平有所升高,但这些变化都在正常的生理指标波动范围内。这表明,MT-W口服后,代谢终产物在小鼠体内有所增加,但不会对其肾脏造成实质性损害。因此,口服MT-W的半致死剂量(LD50)大于5 000 mg/kg/d。总的来说,在不超过5 000 mg/kg体重剂量的情况下,MT-W对昆明小鼠的急性毒性是可控的,不会对其造成伤害。

在经MT-W单剂量灌注的昆明小鼠进行15 d试验后,通过血液样品分析发现无法检测到MT-W,这表明MT-W的生物利用度非常低。口服急性毒性试验和口服生物利用度试验的结果都表明,MT-W难以以完整的形式进入小鼠的血液循环系统。本研究结果表明,MT-W的生物利用度较低,其完整形式没有在血液循环系统中检出。