分光光度法测定富油竹叶糕中亚硝酸盐的不确定度评定
2023-11-29李晓琼周芥锋李超颖李春容胡惠茗
李晓琼，周芥锋**，李超颖，李春容，胡惠茗
(1.长宁县产品质量检验检测中心，四川 宜宾 644300；2.长宁县产品质量检验检测中心，四川 宜宾 644300)
富油竹叶糕由竹叶包裹糯米、红糖、腊肉等原料制作而成，因加入了腊肉而获得了独特的风味和口感，是西南地区的一道传统美食[1]。腊肉中亚硝酸盐残留量是该小吃的食品安全控制点，当成人摄入0.2～0.5 g亚硝酸盐即可中毒，3 g致死[2]。此外，亚硝酸盐在胃酸环境下可转化为亚硝胺，具有诱发癌症的风险，故《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)中规定腌腊肉制品中亚硝酸盐残留量不得超过30 mg/kg[3-4]。因此，探究富油竹叶糕中亚硝酸盐的含量及其测量不确定度尤为重要。
目前，实验室评定不确定度的标准有很多，《测量不确定度评定与表示》 (JJF 1059.1-2012 )、《测量不确定评定和表示》 (GB/T 27418-2017)、《测量不确定度的要求》 (CNAS-CL01-G003：2019)、《化学分析中不确定度的评估指南》 (CNAS-GL006：2019)、《化学分析测量不确定度评定》 (JJF1135-2005)、《检测实验室中常用不确定度评定方法与表示》 (GB/T27411-2012)等[5-10]。
基于此，以宜宾长宁富油竹叶糕为研究对象，采用《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐测定》 (GB/T5009.33-2010)中的第二法[11]，测定富油竹叶糕中的亚硝酸盐残留量，分析不确定度来源，对各分量进行计算，最后合成相对标准不确定度和扩展不确定度。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 原料与试剂
富油竹叶糕样品：四川省长宁县产品质量检验检测中心委托检验样品(将样品用粉碎机粉碎备用)；亚硝酸钠标准储备溶液(200 mg/L)：坛墨质检科技股份有限公司；实验玻璃仪器使用5%硝酸溶液浸泡；硼酸钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、盐酸，均为分析纯试剂；实验用水均为一级水。
1.1.2 仪器与设备
UV2紫外可见分光光度计(龙尼柯(上海)仪器有限公司)；BSA223S电子天平(赛多利斯)。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液的配制
标准储备液稀释：吸取 2.50 mL 上述亚硝酸钠标准溶液，置于 100 mL 容量瓶中，定容制得 5.00 μg/mL 亚硝酸钠中间溶液1；
标准工作曲线配制：吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 中间溶液1(分别相当于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg 亚硝酸钠)，分别置于 50 mL 带塞比色管中。
1.2.2 富油竹叶糕的前处理
称取 5 g 均匀试样，置于 250 mL 具塞锥形瓶中，加 12.5 mL 质量浓度 50 g/L 饱和硼酸钠溶液，加入 70 ℃ 左右的水约 150 mL，混匀，于沸水浴中加热 15 min，取出冷却至室温。定量转移上述提取液至 200 mL 容量瓶中，加入 5 mL 质量浓度 106 g/L 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入 5 mL 质量浓度 220 g/L 乙酸锌溶液，沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置 30 min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液 30 mL，滤液备用。
1.2.3 试样显色处理
吸取 40.00 mL 上述试样滤液于 50 mL 带塞比色管中。向试样管和1.2.1中的标准工作液中分别加入 2 mL 4 g/L 对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置 4 min 后各加入 1 mL 2 g/L 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置 15 min，用 1 cm 比色皿，以空白调节零点，于 538 nm 处测定其吸光度。
1.2.4 数学模型及不确定度来源分析
富油竹叶糕中亚硝酸盐含量按下式(1)计算。
(1)
式中：X为亚硝酸盐质量分数，mg/kg；M1为测定用样液中亚硝酸钠质量，μg；V1为试样处理液总体积为 200 mL；m为试样质量，g；V2为测定用样液体积 40 mL；1000为换算系数。
根据《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐测定》 (GB/T5009.33-2010)中分光光度法测定亚硝酸盐的原理和式(1)分析，紫外分光光度法测定富油竹叶糕中亚硝酸盐的不确定度主要来源如表1所示。
表1 不确定度的来源分析
2 结果与分析
2.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)
2.2 样品处理后定容和移取引入的相对标准不确定度urel(V)
2.2.1 定容所产生的标准不确定度
样品处理后用 200 mL A容量瓶定容，移取 40 mL 样品于 50 mL 具塞比色管中加入试剂并定容。分别在《常用玻璃量器检定规程》 (JJG 196-2006)[13]、《专用玻璃量器检定规程》 (JJG 10-2005)[14]查得 200 mL A级容量瓶的容量允差为 0.15 mL 和 50 mL 具塞比色管的容量允差为 0.40 mL。按均匀分布计算，则由体积引入的标准不确定度结果如表2所示。
表2 体积引入的不确定度
2.2.2 移液管所产生的标准不确定度
50 mL A级分度吸量管在 20 ℃ 下校准合格，实际定容时的温度为21 ℃。在《常用玻璃量器检定规程》 (JJG 196-2006)查得 50 mL A级分度吸量管的容量允差为 0.10 mL。按均匀分布计算，则由体积引入的标准不确定度结果如表2所示。
2.2.3 温度效应所产生的标准不确定度
200 mL 容量瓶、50 mL 比色管在 20 ℃ 下校准合格，实际定容时的温度为 21 ℃。已知液体的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1。按均匀分布计算，则由温度引入的标准不确定度结果如表2所示。
2.3 标准曲线配制引入的相对标准不确定度urel(Q)
2.3.1 标准储备溶液质量浓度引入的不确定度 urel(ρ)
亚硝酸钠标准储备液证书浓度为 200 mg/L，依据证书其相对标准不确定度为2%(包含因子K=2)，则其相对标准不确定度为urel(ρ)=2%/2=0.01。
2.3.2 亚硝酸钠标准中间溶液稀释引入的不确定度
1)5.00 μg/mL 的亚硝酸钠标准中间溶液稀释引入的不确定度urel(Z1)
表3 移取和容量引入的不确定度
2)亚硝酸钠标准工作曲线配置引入的相对标准不确定度urel(G)
取9支 50 mL 比色管，依次准确加入1.2.1所述的亚硝酸钠中间液1，按照1.2.3 试样显色处理，制得亚硝酸钠标准工作溶液。亚硝酸盐标准工作溶液配置过程用到 1000 μL 移液器、5000 μL 移液器、50 mL 比色管，实验室温度波动变化为 ±1 ℃。
表4 标准溶液稀释引入的不确定度
亚硝酸钠标准工作曲线稀释过程中引入的相对标准不确定度为：
则标准曲线配制引入的相对标准不确定度为：
2.4 标准曲线拟合的相对标准不确定度urel(J)
采用9个标准质量点建立标准曲线，每个标准质量点测量3次，取其吸光度(A)平均值，并由平均吸光度(A)与亚硝酸钠质量(m)拟合得到过原点的关系方程，即：A=0.0153 m，相关系数为0.997。测定结果见表5。
表5 标准曲线的测定结果
扣除试剂空白，样品平行测试两次，吸光度分别为0.059和0.060。带入标准曲线方程，得到亚硝酸盐的质量分别为 3.86 μg 和 3.92 μg，平均质量为 3.89 μg。
拟合曲线的偏差为：
标准溶液质量浓度的残差平方和为：
其相对标准不确定度urel(J)=0.176/3.89=0.0452
2.5 仪器测定重复性引入的相对标准不确定度urel(R)
对富油竹叶糕溶液进行6次重复测定，如表6所示。根据标准曲线方程和1.2.4数学模型计算出富油竹叶糕中亚硝酸盐平均质量分数为0.70 mg/kg。
表6 样品的测定结果
根据贝塞尔公式，测定结果的标准偏差为：
测定结果的标准不确定度为：
由紫外分光光度计测定重复性引入的相对标准不确定度为：
2.6 合成相对标准不确定度及扩展不确定度
将亚硝酸钠的各个分量进行合成，其的相对标准不确定度为：
urel(X)=
=0.0544
取置信区间p=95%，K=2，则扩展不确定度为U=0.70 mg/kg×0.0544×2=0.0762 mg/kg。
2.7 测量不确定度报告
实验测定富油竹叶糕中的亚硝酸盐含量为X=(0.70±0.076 2) mg/kg；K=2。
3 结论
采用紫外分光光度法测定富油竹叶糕中的亚硝酸盐含量，当富油竹叶糕中的称样质量为 5.279 g 时，亚硝酸盐的质量分数为(0.70±0.0762)mg/kg，该样品中亚硝酸盐的质量分数小于 30 mg/kg，符合国家标准的限量要求。通过分析并计算主要不确定来源发现，标准工作曲线溶液的配置和标准曲线拟合是主要的不确定度来源，在配置标准溶液的时候必须规范操作。
