高效液相色谱测定大蒜原料及大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的方法研究

◎ 李锦晶，李 凡，易 渡，张沿军

（康宝莱蕾硕（湖南）天然产物有限公司，湖南 长沙 410100）

大蒜在我国的种植历史悠久，作为食物、香料，在国内的产销量一直较高。同时，其作为具有药用价值的食材，在各种疾病的治疗中作为传统民间药物使用[1]，其健康益处主要与有机含硫成分有关[2-3]。大蒜中的有机含硫化合物主要是蒜氨酸和大蒜素2种活性成分，通常用来表征大蒜和大蒜相关产品的质量。由于蒜氨酸酶的存在，蒜氨酸是相当不稳定的，可以迅速转化为大蒜素；大蒜素性质极不稳定，容易分解，不能长期保存。2种活性成分的极性以及稳定性差异较大，导致准确测定大蒜及制品中的蒜氨酸和大蒜素含量的方式也差异较大。其中，蒜氨酸通常用液相色谱测定[4-5]；大蒜素有用气质联用仪[6-7]进行测定， 但更多采用分光光度法[8-9]或者反相色谱[10-11]测定。因此，建立一种同时测定2种物质的方法，可以极大提高分析效率。

在本研究中，我们开发了一种将蒜氨酸标准品转化生成大蒜素的方法， 并建立了一种控制其转化的方法。测定方法的关键在于防止蒜氨酸转化为大蒜素，并在样品制备和分析中，同时稳定蒜氨酸和大蒜素。本研究采用改进的柱前衍生的样品制备方法，不仅可以减少传统提取方法中常见的干扰，而且可以同时测定蒜氨酸和大蒜素。

1 材料与方法

1.1 材料

蒜氨酸标准品， USP, 目录# 1012950; 乙腈，HPLC级；乙酸铵，ACS级； 三水合醋酸钠，ACS ；邻苯二甲醛（OPA）试剂，安捷伦# 5061-3335 （打开后可在冰箱中保存不超过2周）; 十水四硼酸钠，GR级；半盐酸羧甲氧基胺，ACS级 。

1.2 仪器

Waters 2695液相色谱仪，包括泵、脱气器、自动进样器、温度控制模块和PDA检测器；分析天平；旋涡混合器；研磨机；超声发生器；振荡器；离心机。

1.3 溶剂准备

①蒜氨酸酶抑制剂溶液（1 mg·mL-1）：100 mg半盐酸羧甲氧基胺到100 mL纯净水中。②硼酸缓冲溶液（pH 9.0）: 将1.9 g十水四硼酸钠溶解在约100 mL的纯净水中，用0.2 mol·L-1硼酸调整pH值为9.0。

1.4 试验方法

1.4.1 蒜氨酸测试样品溶液的制备

称取100 ～1 000 mg （精确到0.1 mg) 之间的粉末样品装入35 mL螺旋盖试管中，加入蒜氨酸酶抑制剂溶液 （1 mg·mL-1） 20 mL，涡旋30 s。超声15 min，每隔5 min手动摇5 s。用0.2 μm针式过滤器过滤，丢弃前几滴滤液，收集约5 mL样品至一个小烧杯中。

1.4.2 衍生化程序

在小瓶中加入硼酸缓冲液50 μL， 样品液10 μL，涡旋10～15 s，再加入OPA试剂10 μL，旋涡10～15 s，等待2 min左右加入纯水130 μL，将此溶液放入HPLC进样瓶用于分析。

1.4.3 大蒜素测试样品溶液的制备

称取100～1 000 mg （精确到0.1 mg）之间的粉末样品装入35 mL螺旋盖试管中，加入20 mL醋酸钠缓冲液，涡旋30 s左右。超声15 min，每隔5 min手动摇动5 s。静置10 min后，加入半盐酸羧甲氧基胺 约20 mg，涡旋30 s。用0.2 μm针式过滤器过滤，丢弃前几滴滤液，放入HPLC进样瓶用于分析。

1.5 测定蒜氨酸及大蒜素的色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA,150×4.6 mm；检测波长：254 nm、520 nm；流动相A：20 mmol乙酸铵；流动相B：乙腈/水=90/10（体积比）；梯度洗脱程序见表1；样品温度：5 ℃；流速：1 mL·min-1；进样体积：20 μL（如表1）。

表1 梯度洗脱程序表

1.6 标准溶液准备

1.6.1 蒜氨酸标准原液

精确称量约10 mg（精确到0.01 mg）蒜氨酸参考标准倒入10 mL容量瓶中，加入约6 mL水，将溶液超声处理10 min，用水稀释至刻度，摇匀备用。

1.6.2 蒜氨酸工作标准溶液

工作标准溶液1：将1 mL蒜氨酸原液标准溶液移至10 mL容量瓶中，用水稀释至刻度并摇匀。工作标准溶液2：将2.5 mL蒜氨酸原液标准溶液移到5 mL容量瓶中，用水稀释至刻度并摇匀。工作标准溶液3：蒜氨酸原液标准溶液作为工作标准溶液3。每次工作溶液使用时，用0.2 μ注射器过滤器过滤储存溶液，并遵循衍生化程序进行衍生化。

1.6.3 大蒜素工作标准溶液

取1.0 mL蒜氨酸工作标准溶液2（约0.50 mg·mL-1），加入100 μL粗蒜氨酸酶溶液，室温静置10 min。用水稀释，用0.2 μ注射器过滤器过滤。

其中，162.26: 大蒜素的分子量；354.42: 蒜氨酸分子量的2倍。

2 结果与分析

2.1 衍生化溶液pH值对蒜氨酸产率和稳定性的影响

如图1所示，蒜氨酸面积随着缓冲液的pH值增加而增加。当缓冲液的pH值在4.0 ～ 5.5之间时，蒜氨酸的衍生转化效率较低；当缓冲液pH值为5.5～10.0时，蒜氨酸衍生化反应效率转化较高且没有明显变化。伴随碱度的增加，蒜氨酸衍生化产物变得更加稳定。当pH值在9.0～10.0之间时，降解率不超过5%，蒜氨酸稳定时间至少为48 h。

图1pH 值对蒜氨酸稳定性的影响图

2.2 提取液pH值对大蒜素产率和稳定性的影响

考察了不同pH值下大蒜素的得率和稳定性。在大蒜素样品的制备过程中，使用了一系列pH值为4.0 ～8.0的提取液。在5 ℃下保存，分别在0、8、10、15和21 d时评价大蒜素的稳定性。

结果如图2所示，当pH值为4.0时，大蒜素产率很低，且没有明显变化。当pH值为4.5 ～8.0时，反映出大蒜素在酸性条件下比在碱性条件下更易分解。当pH值在5.0～8.0之间时，大蒜素保持稳定至少10 d。综合考虑大蒜素得率、稳定性和蒜氨酸酶活性[12]，选择pH 6.0的缓冲液作为提取液。

图2pH值对大蒜素稳定性的影响图

2.3 温度对大蒜素溶液的影响

考察了大蒜素在不同贮藏温度下的稳定性。提取后，大蒜素样品溶液分别在室温和5 ℃下保存0、2、4、10、16和40 h，0、8、10、15和21 d后进行评价。

从图3、图4可以看出，大蒜素在温度为5 ℃时最为稳定，15 d后仅略有下降，降解率不超过5%。在室温（25 ℃）下，该化合物的分解趋势更为明显，但呈渐进式，16 h后分解速率为9%。

图3 25 ℃大蒜素样品的稳定性图

图4 5℃大蒜素样品的稳定性图

2.4 精密度

每个样品按试验方法制备6个重复样品， 将样品与新配制的标准溶液进行对比分析。计算了各样品中蒜氨酸和大蒜素的含量。如表2、表3所示，蒜氨酸和大蒜素6个结果的RSD均不大于2%。

表2 大蒜提取物中蒜氨酸及大蒜素的精密度结果表（大蒜提取物， R11255)

2.5 准确度 （加标回收率）测试

考虑到基体干扰方法的准确度，本研究采用标准加入法，已知量的蒜氨酸和大蒜素原液被添加到样品溶液中，为方便测定， 根据各样品中目标化合物本底值不同，分别以3个水平加标，每个水平做3次重复，测量的加标样品中每个组分的量相对于样品中相应组分的加入量被计算为回收率。在此基础上，以精密度试验得到的大蒜提取物和大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的浓度，作为试验样品中蒜氨酸和大蒜素的基线含量，分别计算了加标样品中发现的蒜氨酸和大蒜素的数量与预期的蒜氨酸和大蒜素的回收率。

如表4所示，蒜氨酸和大蒜素的加标回收率均在80%～120%之间。原料和片剂这两种基质的方法学验证结果差别不大， 6种目标化合物的平均回收率在90%～110%, 说明此方法具有较高的稳定性和精密度。

表4 大蒜提取物和大蒜片中蒜氨酸的准确度结果表

3 结论

当前，学界许多研究对于蒜氨酸以及大蒜素的测定都是采用分开的方法，而本研究通过柱前衍生化反应，选取pH 6作为萃取条件，使用安捷伦ZORBAX Eclipse AAA色谱柱为分离柱，同时测定蒜氨酸以及大蒜素。样品再现性以及加标回收率试验结果表明，该方法准确可靠、精密度较好，可应用于大蒜原料、大蒜片中的蒜氨酸及大蒜素的测定。