柴胡加龙骨牡蛎汤化裁对失眠小鼠的神经调节机制探索

王志红 李红培 邢佳 李宇霄 吕丽佳 王一帆 王嘉麟

良好的睡眠是身心健康和生活质量的保证。而在现代社会,睡眠不足成为了普遍现象。大量研究表明,睡眠不足会导致包括神经系统、心血管系统等各类疾病的发生[1]。失眠属于长期睡眠不足,包括入睡困难和维持睡眠困难,因睡眠困难、睡眠时间短或睡眠质量不佳而影响白天社会功能,呈一种病理性主观体验,其较睡眠不足危害更大。根据流行病学调查数据显示,我国失眠普遍患病率为15%,老年人失眠率高达50%[2-3]。随着人们生活节奏加快,社会、工作压力不断增加,失眠人群愈发趋于年轻化。失眠作为常见的睡眠障碍之一,严重影响患者身心健康和生活质量,但只要及时适当采取干预措施,大部分患者症状可有所改善[4]。

临床上通过中医特色诊疗手段(如汤药、针灸等)改善睡眠的有效案例不胜枚举。笔者于临床多以柴胡加龙骨牡蛎汤化裁治疗失眠,大多收获满意疗效[5]。本实验通过观察柴胡加龙骨牡蛎汤化裁方对失眠小鼠的短期干预探讨其改善睡眠的神经调节机制,拟从客观指标上对其做出疗效评价,以期为临床推广提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级昆明种雄性小鼠40只,体质量20～22 g,采购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物合格证号:SCXK(京)2016-0002。按照中华动物伦理学要求饲养和处理动物。实验开始前,予统一饲养条件并适应环境3天。

1.2 实验药物

柴胡加龙骨牡蛎汤化裁方:柴胡10 g、黄芩9 g、清半夏9 g、党参10 g、酸枣仁30 g、川芎6 g、知母6 g、生龙骨15 g、生牡蛎15 g、磁石30 g、茯苓12 g、大黄3 g、生姜9 g、大枣9 g、桂枝5 g,由北京康仁堂药业有限公司制作配方颗粒。

酒石酸唑吡坦片[赛诺菲(北京)制药有限公司,10 mg/片,批号:5T006]。

1.3 主要试剂、仪器与设备

对氯苯丙氨酸(Selleck,500 mg/支,批号:S4586);戊巴比妥钠(P3761 Sigma,USA,批号:P12149);鼠断头器(XYC北京哲成科技有限公司);小鼠5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutanoic acid,GABA)ELISA试剂盒(AMEKO公司);Sunrise酶标仪(TECAN公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 给小鼠自然昼夜节律及光照、自由饮水、摄食,适应性饲养3天。3天后通过随机数字表法将40只小鼠分为空白对照组、模型组、柴胡组(柴胡加龙骨牡蛎汤治疗)、唑吡坦组(酒石酸唑吡坦片治疗),每组10只。

1.4.2 模型建立 实验组(包括模型组、 柴胡组、 唑吡坦组)小鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸(300 mg/kg,10 g/0.1 mL),空白对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。每日1次,共3日。

1.4.3 给药方法 根据人鼠给药剂量体表面积折算公式:鼠给药剂量=人给药剂量×0.9×(人体重/鼠体重)×1/3,柴胡组给予柴胡加龙骨牡蛎汤化裁颗粒3 g/kg灌胃,唑吡坦组给予酒石酸唑吡坦片5 mg/kg灌胃,模型组与空白对照组分别给予生理盐水灌胃,共给药7天,每日1次。给药期间,除柴胡组1只小鼠死亡外,其余小鼠全部存活。

1.5 取材与指标检测

最后一次给药12小时后将全部小鼠处死:2%戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉,鼠断头器迅速断头,冰上快速剥离完整脑组织,随即放入培养皿(置于冰上)中,分离脑干和前脑,置于-80℃冰箱待用。检测时,样品室温解冻,按照每100 mg组织加入1 mL生理盐水的标准,进行研磨和反复冻融,待细胞膜完全破坏后,将组织匀浆于4℃ 5 000 r/min条件下离心5分钟,取上清液,按照ELISA试剂盒说明书进行操作。利用全自动酶标仪,测定各孔的OD值,并绘制标准曲线,计算对应的浓度值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 造模结果

小鼠为昼伏夜出型生物,在第3日腹腔注射对氯苯丙氨酸后24小时,测量实验组小鼠体质量较空白对照组轻4～6 g,且更易受惊吓,并观察到实验组小鼠均出现不同程度昼夜节律紊乱,表现为白天兴奋,说明造模成功。见表1。

表1 造模成功后各组小鼠体质量情况

2.2 各组小鼠脑干中5-HT含量比较

造模后,模型组小鼠脑干中5-HT含量较空白对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。给药后,唑吡坦组、柴胡组小鼠脑干中5-HT含量高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);柴胡组与唑吡坦组小鼠脑干中5-HT含量无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠脑干中5-HT含量比较

2.3 各组小鼠脑干中5-HIAA含量比较

造模后,模型组小鼠脑干中5-HIAA含量较对空白照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。给药后,唑吡坦组、柴胡组小鼠脑干中5-HIAA含量高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);柴胡组与唑吡坦组小鼠脑干中5-HIAA含量无显著性差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠脑干中5-HIAA含量比较

2.4 各组小鼠脑干中GABA含量比较

造模后,模型组小鼠脑干中GABA含量较对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。给药后,唑吡坦组、柴胡组小鼠脑干中GABA含量高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);柴胡组与唑吡坦组小鼠脑干中GABA含量无显著性差异(P>0.05)。见表4。

表4 各组小鼠脑干中GABA含量的比较

3 讨论

睡眠—觉醒是确保机体正常运作所必需的。充足的睡眠能够保证身体充分参与体内的昼夜节律,为各项身体机能的顺利发挥提供能量储备。当今社会百态的压力造就了失眠人群的激增和年轻化,患者常表现为不同程度的睡眠—觉醒节律紊乱。失眠可以作为单一病症出现,也可能是其它疾病的伴随或继发症状。严重的失眠会影响患者认知功能和情绪状态,继而加重失眠,这些神经系统症状的恶性循环与氨基酸类神经递质、单胺类神经递质的分泌改变存在一定关系[6]。

5-HT能神经元可以对睡眠—觉醒进行双相调控[7-8],它既可以通过促进下丘脑有催眠效应的肽类物质累积,同时也能够协同去甲肾上腺素、多巴胺等其余单胺类神经递质,共同调控大脑睡眠。脑干中缝核内存在大量5-HT能神经元,若脑干功能遭到破坏,可引发完全性失眠。5-HIAA作为5-HT的代谢产物,可间接反映5-HT的含量与功能,5-HT和5-HIAA之间呈正相关关系。单胺氧化酶(5-HT转化成5-HIAA的限速酶)活性在24小时睡眠剥夺后显著增高,而随着剥夺时间的延长逐渐减少[9]。在短期睡眠剥夺后,5-HIAA的含量也会随之下降。

实验证明,通过药物干预激活5-HT能系统可以促进睡眠[10]。脑干网状结构协同氨基酸类神经递质构成的睡眠—觉醒神经调节回路,对睡眠—觉醒的运作和维持起着至关重要的影响。GABA约占脑干网状结构所有神经元含量的三分之一,是一种抑制性神经递质,能够对蓝斑、中缝核以及中脑腹侧被盖区的单胺能促觉醒系统产生抑制,从而发挥促眠作用[11-12]。失眠患者普遍存在GABA含量下降[13]。

诸多证据表明,中草药及其活性成分或可通过调控中枢单胺类神经递质、氨基酸类神经递质而发挥镇静催眠作用[14-16]。失眠属于中医“不寐”范畴,古名“目不瞑”“不得眠”。该病首载于《足臂十一脉灸经》,时称“不卧”“不得卧”“不能卧”。直至《难经·四十六难》首先提出“不寐”之名:“老人卧而不寐,少壮寐而不寤者,何也?然:经言少壮者,血气盛,肌肉滑,气道通,营卫之行不失于常,故昼日精,夜不寤也。老人血气衰,肌肉不滑,营卫之道涩,故昼日不能精,夜不能寐也,故知老人不能寐也”“老人之寤而不寐,少壮之寐而不寤,系乎营卫血气之有余不足也”,并对其病因病机做了初步论述。《灵枢·大惑论》则更为详尽地阐释了该病的发病病机:“卫气不得入于阴,常留于阳。留于阳则阳气满,阳气满则阳跷盛;不得入于阴则阴气虚,故目不瞑矣。”虽后世诸多医家对于失眠症的理解有了更细化的发挥和更精准的理解,但失眠的发生总归于《内经》所说之阳不入阴、营卫失和、脏腑失衡。

柴胡加龙骨牡蛎汤出自张仲景《伤寒论》第107条“伤寒八九日,下之,胸满烦惊,小便不利,谵语,一身尽重,不可转侧者,柴胡加龙骨牡蛎汤主之”。此类病机以少阳枢机失运、三焦不畅为主的病证,当以柴胡加龙骨牡蛎汤和解少阳、通阳泻热、重镇安神[17]。小柴胡汤去甘草加龙骨、牡蛎、铅丹、大黄、桂枝、茯苓而成的柴胡加龙骨牡蛎汤方,方中柴胡、黄芩二者合用既纾解肝气又可除湿退热,桂枝通阳化气,解表同时可助柴芩之效,龙骨、牡蛎共奏重镇安神之功,合坠痰下气者铅丹,安神镇惊效果更著,半夏、生姜和胃降逆顺气,使卧安眠好,茯苓利小便,大黄通腑,二便调和则纳寐自佳,再添人参、大枣二味补气养营而安神,去有甘缓留邪之嫌的甘草,遂成此集升降、补泻、温清并存方,可解表里错杂之邪。

现代人或压力过大、精神过度紧张,或暴饮暴食、饮食不合理,或久坐久卧、缺少运动,多表现为情志烦躁、脾胃失和、大便不通、失眠多梦等少阳枢机失运、三焦不畅之象,辨证为此之内伤杂病皆可用去铅丹(铅丹由于其毒性,以类效的磁石替代)加磁石的柴胡加龙骨牡蛎汤加减化裁。肝气郁结或痰热内扰,均可引起少阳枢机不利出现失眠,这是现代人失眠的主导因素。现代医家也多用该方治疗因气机阻滞兼见情志不遂的失眠,皆有确切疗效[18-22]。考虑到现代人多有因工作、生活学习压力大而致饮食不合理,以致脾胃多虚的情况,笔者在运用柴胡加龙骨牡蛎汤原方基础上,常常以党参代人参,加大健脾力度,并稍佐酸枣仁、川芎、知母,旨在合酸枣仁汤之意兼以疏肝养血安神、清心除烦,从而增强其安神功效。

本实验验证,柴胡加龙骨牡蛎汤化裁方确可改善小鼠的失眠现象,可能与其能够促进小鼠脑干中5-HT、5-HIAA、GABA的分泌,从而调节睡眠—觉醒有关,其短期疗效和酒石酸唑吡坦相当。故临床可据患者四诊辨证,以此方化裁应用。正常睡眠—觉醒受不同脑区多种神经递质调控。因大脑生理结构的特殊性,关于失眠发生的神经生物学机制大部分仍局限于动物实验研究层面。本实验虽从神经递质入手对柴胡加龙骨牡蛎汤化裁方调节失眠的可能机制进行了初步验证,但仍存在一定局限性,该方的作用靶点是否与其余脑区神经递质的含量改变存在相关性尚未可知,后续还需要深层次全面化的探索。