黄花羊耳蒜醇提物及不同极性溶剂萃取物对肿瘤细胞增殖的影响

陈小兵 黄丽芸 周沛润 许 军 钟卫津

羊耳蒜属为兰科多年生草本植物，全世界约有428 种，我国约有52 种，广泛分布于我国西南部各省份和地区[1]。其中约有20 种羊耳蒜属植物作为药用植物，有着比较久远的民间用药历史记载。该植物属历代记载中具有清热解毒、凉血止血、消肿止痛等功效，可用于治疗产后腹痛、外伤、炎症等[2-4]。

关于黄花羊耳蒜醇提物及不同极性溶剂萃取物对人慢性髓原白血病细胞（K562）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人肺癌细胞（A549）3 种细胞增殖的影响尚未见报道。本研究制备了黄花羊耳蒜醇提物以及3 个不同极性溶剂萃取物和水溶性部位，通过实验考察不同极性溶剂萃取物对体外培养A549、MCF-7 和K562 增殖情况的影响。

1 材料与方法

1.1 药材

黄花羊耳蒜全草于2019年8月采自赣南地区，作为标本的全草性状及特征依照有关文献的描述，经国家二级技师颜干明博士鉴定为黄花羊耳蒜。凭证样品保存在赣南卫生健康职业学院中药标本室。

1.2 黄花羊耳蒜醇提取物的制备

取黄花羊耳蒜全草2 kg，用90%乙醇浸泡24 h，萃取3 次，合并3 次浸泡液，用旋转蒸发仪减压蒸馏乙醇，制备得到浓缩物并通过冷冻干燥，得黄花羊耳蒜醇提物180 g，保存于干燥器皿中。

1.3 黄花羊耳蒜不同极性溶剂萃取物及其水溶性部位的制备

称取适量黄花羊耳蒜醇提取物，加入双蒸水将提取物溶解，制备浓度为1 mg/ml 的液体备用。然后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3 种溶剂分别萃取3 次，将萃取液减压蒸馏有机溶剂后制备得到浓缩物并通过冷冻干燥，制备得到3 个不同极性溶剂萃取物。黄花羊耳蒜的提取液经萃取后的水层部位，通过减压浓缩、冷冻干燥，制备得到水溶性部位。

1.4 样品液的制备

称取制备好的黄花羊耳蒜醇提物、水溶性部位成分，用适量Ham's F-12 营养混合物溶解；称取黄花羊耳蒜3 个不同极性溶剂萃取物，用适量浓度为含0.1%二甲基亚砜的Ham's F-12 营养混合物溶解，制备作用于细胞的各种样品液的最终浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.075 mg/ml 5 个梯度的备用液。

1.5 细胞株

A549、MCF-7、K562 3 种肿瘤细胞购买于美国ATCC 公司。

1.6 试剂及仪器

MTT（德国默克有限公司），Ham's F-12 营养混合物、胎牛血清、胰蛋白酶（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

真空冷冻式燥机（上海舜制仪器制造有限公司），RV-0005 型旋转蒸发仪（仪生仪世（上海）生物科技有限公司），MR-96A 酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），MI52-N 型倒置显微镜（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），二氧化碳培养箱（山东博科干细胞应用研究院有限公司）。

1.7 细胞培养

A549、MCF-7、K562 肿瘤细胞在含有10%胎牛血清和10% Ham's F-12 营养混合物的培养基中，于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养，保持环境湿润，取对数生长期细胞用于本实验中。

1.8 抗肿瘤活性的研究

按照MTT 法[5]，取对数生长期的A549、MCF-7、K562 细胞用含Ham's F-12 营养混合物的培养基稀释至105mg/ml，将A549、MCF-7、K562 细胞分别接种在96 孔培养板中，每孔0.1 ml，24 h 后将培养液除掉，在每个孔中加入样品0.1 ml，每组均设置4 个复孔。同时设置空白组（加Ham's F-12 营养混合物0.1 ml）以及阳性对照组，各组均设置8 个复孔。其中用于黄花羊耳蒜石油醚、正丁醇、乙酸乙酯萃取物实验的空白组每孔加入含有0.5% Ham's F-12 营养混合物的培养基0.1 ml。于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，保持环境湿润，培养72 h 以后，每孔加入0.01 ml、浓度为3 mg/ml 的MTT，然后放置在培养箱中继续培养8 h 后吸取每孔中的溶液，将二甲基亚砜0.15 ml 加入其中，最后在水平摇床上将培养板缓慢振摇20 min，将培养板置于酶标仪上，并检测其吸光度值（A），于波长495 nm 处检测。最后按照公式，细胞抑制率（%）=（1-样品组的A 值/对照组的A 值）×100%[5]，计算得到细胞抑制率。同时计算细胞的半数抑制浓度（IC50）。

2 结果

黄花羊耳蒜醇提物的不同极性萃取部位对肿瘤细胞增殖的影响见表1。实验显示，黄花羊耳蒜醇提物对A549 细胞增殖有明显的抑制作用，且与浓度的增加有明显关联，对其他两种细胞增殖无明显影响。黄花羊耳蒜醇提物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位浓度高时对A549 肿瘤细胞增殖有一定抑制作用。黄花羊耳蒜醇提物的正丁醇萃取部位浓度高时对A549、K562 和MCF-7 肿瘤细胞增殖均有一定抑制作用。黄花羊耳蒜醇提物的水溶性部位对A549、K562 和MCF-7 肿瘤细胞的增殖无明显作用。

表1 黄花羊耳蒜醇提物及不同极性溶剂萃取物对肿瘤细胞增殖的抑制率

3 讨论

本研究对黄花羊耳蒜醇提物进行了不同极性部位的成分富集，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3 种溶剂分别萃取，得到黄花羊耳蒜醇提物的3 种不同溶剂萃取物以及水溶性部位，并进行了体外抗肿瘤活性实验。研究表明，黄花羊耳蒜醇提物对体外培养的A549、MCF-7 两种肿瘤细胞增殖有明显抑制作用。黄花羊耳蒜石油醚萃取物，在高浓度时对A549 和MCF-7 两种肿瘤细胞增殖也有一定抑制作用，提示黄花羊耳蒜的抗肿瘤活性成分有可能存在于该部位；黄花羊耳蒜乙酸乙酯萃取物对A549 和K562 增殖有明显抑制作用，且与浓度有直接关系；黄花羊耳蒜正丁醇萃取物高浓度时对A549、K562和MCF-7 增殖均有一定的抑制作用，提示黄花羊耳蒜的抗肿瘤活性成分也有可能存在于该部位。